宁夏老龄枸杞园撂荒过程中土壤理化性质和细菌群落变化特征

韩新宁，张 慧，张俊华，王 芳，李 明

（1.宁夏师范学院化学化工学院，宁夏 固原 756000；2.宁夏师范学院数学与计算机科学学院，宁夏 固原 756000；3.宁夏大学生态环境学院，银川 750021；4.宁夏大学地理科学与规划学院，银川 750021；5.宁夏大学食品与葡萄酒学院，银川 750021）

0 引 言

宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）是宁夏的支柱产业之一。随着种植年限的延长，枸杞园土壤有机质和养分含量先增加后减少，约9年时肥力质量最高，然后开始退化[1]，微生物多样性逐渐降低、数量减少[2,3]，对根系生物活性的毒害作用增大[4]；约12年后枸杞品质和产量显著下降，一般植株砍伐后改种其他作物，但弃耕现象也时有发生。农田弃耕撂荒是一种生态系统的自然恢复措施，对不同恢复阶段土壤肥力和微生物群落进行研究，能够及时了解土壤质量变化趋势，改进土壤管理措施，有助于土壤资源的可持续利用[5]。

土壤类型、撂荒年限及土壤深度对土壤理化性状和微生物群落影响都较大[6,7]。如川中丘陵区耕地撂荒后土壤砂粒增加，粉粒减少；撂荒后土壤有机碳、全钾、碱解氮略有增加，全氮显著增加，C/P 和N/P 极显著升高，而全磷、有效磷、速效钾和C/N 显著降低[8]。昆明东北部的耕地撂荒后土壤全氮增加61.5%，而碱解氮增幅并不显著；随着撂荒年限的增加，20～40 cm 有机质、全氮、全磷波动中呈现上升趋势；土壤酶活性则表现为表层高于下层[9]。Nyamadzawo等[10]和Datta等[11]都发现撂荒后土壤碳含量和有机碳储量在表层显著提高，但随着深度的增加逐渐降低[12]。Hepp 等[13]和Meyer 等[14]指出撂荒4年及更长时间后土壤总有机碳和易氧化有机碳含量呈下降趋势。黄土高原撂荒地有机碳、全氮、MBC、MBN、全FAME、真菌、细菌和G-含量均高于农用地，有助于改善该地区土壤微生物特性[15]。微生物群落物种丰富度在撂荒前15年呈上升趋势，之后迅速下降[6]。目前，关于耕地撂荒的环境效应是积极还是消极，一直存在争论[16]。

虽然目前宁夏老龄枸杞园撂荒现象并不普遍，但已有增加趋势，而关于撂荒对土壤质量的影响却鲜见报道。为此，本研究系统探究了宁夏老龄枸杞园不同撂荒年限土壤理化性质和细菌群落组成及多样性变化趋势，然后分析了二者的相互关系，旨在为撂荒枸杞园土壤质量演变、复耕和综合治理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集及处理

宁夏中卫市中宁县（105°26ˊ～106°7ˊE，37°09ˊ～37°50ˊN）是宁夏枸杞品质最好、种植面积最大的地区。选择该县种植12年以上的老龄枸杞园5 处，2017年还在采摘中，但由于枸杞品质和产量严重下降，从2018年开始同时被农户弃耕撂荒（撂荒后枸杞植株均没挖走，但大多已逐渐枯死，园内也没有任何水、肥、药管理，杂草丛生）。本研究于2017-2021年7月底连续5年（分别表示撂荒前对照、撂荒第1年、第2年、第3年和第4年，编号分别为CK、A1、A2、A3和A4）在距离枸杞植株冠层正下方采集0～20 和20～40 cm 土壤样品（D1 和D2）。每个土样均选择在5 棵枸杞植株下采集，相同土层混匀后保留1.0 kg立即封口并放入保温箱带回实验室。土样剔除杂质后，测定含水量，并将剩余样品分为两份，一份-20 ℃保藏，用于土壤微生物群落的测定，另一份风干后测定土壤基本理化性质指标。

1.2 土壤基本理化性质测定方法

土壤含水量—烘干法；pH值—酸度计法；全盐—质量法；有机质—外加热法；全氮—凯氏定氮法；碱解氮—碱解扩散法；速效磷—Oslen 法；速效钾—乙酸铵提取-火焰光度计法；铵态氮—蒸馏法；硝态氮—紫外分光光度法。

1.3 微生物测定方法

土壤DNA提取。采用Power soil DNA Isolation Kit 土壤微生物总DNA 提取试剂盒提取土壤细菌总DNA。提取后的DNA 产物经琼脂糖凝胶电泳后进行检测，合格DNA 稀释至1 ng/L 保存于-80 ℃用于PCR扩增。

PCR 扩增及测序。细菌核糖体编码基因相应区段的扩增及测序服务由北京诺禾致源生物信息公司完成。土壤DNA 提取完成后，进行16S rDNA 的V4 区扩增，所用引物为515F/806R （5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′/5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。高通量测序由诺禾致源Illumina HiSeq 2500 平台运行，最后所测得数据在250～300 bp 之间产生。

1.4 数据统计分析

数据分析采用Excel、SPSS 20.0 和CANOCO 4.5 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 撂荒枸杞园土壤基本理化性状

与撂荒前相比，枸杞园撂荒后0～40 cm 土层含水量普遍显著增加（表1）；含盐量、全氮、NH4+-N和NO3--N含量均显著下降。撂荒第4年表层土壤含水量、有机质和碱解氮比对照土壤分别增加18.55%、23.70%和60.15%，而含盐量、全氮、速效磷、NH4+-N 和NO3--N 分别降低68.70%、47.78%、30.94%、34.34%和91.50%。随着撂荒年限的增加，0～20 cm 土层有机质、碱解氮和速效磷含量整体显著增加，全氮则逐渐减少；pH、全盐、速效钾、NH4+-N 和NO3--N 含量变化无规律；20～40 cm土层各理化指标变化也无明显规律。

表1 不同撂荒年限枸杞园土壤基本理化指标变化情况Tab.1 Soil physicochemical properties at different abandoned ages in Lycium barbarum L.old orchard

2.2 撂荒枸杞园土壤微生物群落多样性

撂荒第1年枸杞园0～20 cm 土壤Richness、Shannon、Chao1 和ACE 都小于撂荒前（表2），但20～40 cm 各指标均显著高于撂荒前（除Shannon未达显著水平）。从撂荒第1年到第3年，表层土壤Richness、Shannon、Chao1 和ACE 均逐渐增大，且除Shannon外增幅都达显著水平，第4年时又有所降低，各指数水平与撂荒第2年相当。在20～40 cm 土层，撂荒第2年到第4年，土壤Richness、Shannon、Chao1 和ACE 均逐渐增大，其中Richness、Chao1 和ACE 增幅均达显著水平。所以，在老龄枸杞园撂荒过程中，细菌多样性指数有增大趋势，但表层与表下层变化规律不尽相同。

表2 不同撂荒年限枸杞园土壤细菌群落多样性指数Tab.2 Characteristics of diversity of soil bacterial communities at different abandoned ages

2.3 撂荒枸杞园土壤细菌群落组成

在门水平上，枸杞园0～40 cm 土层撂荒前后土壤相对丰度最高的3 个优势菌门依次均为Proteobacteria、unidentified_Bacteria 和Acidobacteriota（图1）。在相对丰度较高的前10 个菌门中，与对照相比，撂荒园Proteobacteria、Acidobacteriota和Nanoarchaeota 相对丰度分别增加15.19%、28.38% 和53.11%，但Bacteroidota、Actinobacteriota 和Cyanobacteria 相对丰度分别减少26.72%、40.09%和46.13%。撂荒园土壤中，不同土层优势菌门相对丰度差异也较大：0～20 cm 土层Proteobacteria、Bacteroidota 和Actinobacteriota 分别比20～40 cm高25.26%、160.37%和32.02%，而Chloroflexi、Crenarchaeota和Nanoarchaeota 比20～40 cm 低31.88%、74.03% 和74.00%。随撂荒年限的增加，表层Proteobacteria、Actinobacteriota 相对丰度逐渐增大，unidentified_Bacteria、Acidobacteriota则有逐渐减小的趋势。

图1 撂荒枸杞园土壤细菌优势菌门相对丰度Fig.1 Relative abundances of dominant bacteria at phylum level in soil at different abandoned ages

2.4 撂荒枸杞园土壤细菌群落结构组成分析

通过高通量测序，对数量在前30 位的属做热图进行分析（图2）。撂荒后土壤优势菌属为MND1、Sphingomonas、RB41、Pseudomonas 和Nitrosarchaeum 等，撂荒前土壤优势菌属为Pseudomonas、MND1、RB41、Nitrosarchaeum 和Sphingomonas等。与撂荒前相比，撂荒后土壤Hymenobacter、Limnobacter、Cavicella、Polaromonas、Luteolibacter、Planococcus、Nafulsella、Brevundimonas、Devosia、Massilia 和Sphingomonas 数量分别增加了13.18、8.97、6.24、4.02、3.42、2.69、2.25、2.11、2.02、1.28 和0.99 倍，增幅均达极显著水平，而Candidatus_Methylomirabilis、Flavisolibacter、unidentified_Chloroplast、Pseudomonas、Sphingobacterium、Salinimicrobium、Pontibacter和Lysobacter 分别降低了91.37%、72.98%、64.79%、59.24%、53.94%、44.23%、42.64%和37.17%。虽然撂荒后0～20 cm 土层和20～40 cm 土层数量最多的3 个属都是Sphingomonas、RB41 和MND1，但0～20 cm 土层Sphingomonas 比20～40 cm 高84.16%，而RB41和MND1则低了25.04%和25.82%。

图2 不同撂荒年限土壤属水平优势细菌相对丰度Fig.2 The relative percentages of the bacterial genus in soil at different abandoned ages

2.5 撂荒枸杞园土壤微生物群落结构主成分分析

主坐标分析（PCoA）是一种常用的数据降维方法，可反映各个样本群落组成的相似性或差异性。样本间距离越小，细菌群落组成的相似度越高；反之，细菌群落组成的差异性越大[17]。由图3可以看出，撂荒前和撂荒第1年的土壤与撂荒2～4年的土壤细菌群落结构差异较大，表层微生物群落结构间差异大于表下层。

图3 不同撂荒年限土壤细菌群落主坐标分析Fig.3 Principal coordinates analysis of bacteria communities structures of soil at different abandoned ages

2.6 撂荒枸杞园土壤基本理化性质与微生物群落的关系

Pearson 相关分析表明（表3），土壤含盐量、全氮和NO3--N 含量与撂荒枸杞园土壤细菌群落多样性指标关系较密切，且多样性指数普遍与这3个指标呈显著或极显著负相关关系。在10 个优势菌门中，除unidentified_Bacteria 和Firmicutes和各理化指标关系较差外，其他8种优势菌门与其普遍有较强的相关性，其中，Cyanobacteria、Bacteroidota、Proteobacteria、Actinobacteriota 与土壤养分呈极显著正相关关系，而Crenarchaeota、Acidobacteriota、Chloroflexi、Nanoarchaeota 与养分普遍呈显著或及显著负相关关系；Cyanobacteria、Bacteroidota 与土壤含水率、pH 均呈显著或极显著负相关；Acidobacteriota 与pH 和全盐呈极显著负相关，而Actinobacteriota则与这两个指标呈极显著正相关关系。

3 讨 论

3.1 撂荒枸杞园土壤基本理化性质变化

连作常造成土壤养分失衡、微生物多样性下降[18]。老龄枸杞园由于枸杞产量和品质严重下降，故被弃耕撂荒。随着撂荒年限的增加，枸杞根系逐渐死亡，自然植被大量生长，每年都有较多枯落物进入土壤，经微生物分解后逐渐转化为有机质和养分[19]，所以表层土壤有机质、碱解氮、速效磷逐渐增加。Yang 等[20]研究指出，短期撂荒能显著提高表层土壤总有机碳含量，而较深土层的碳固持能力会变弱，与本研究结论一致。随着撂荒年限的增加，土壤全氮含量逐渐降低，可能是因为枸杞园撂荒前每年都施用较多氮肥，在撂荒前期还有部分未被枸杞植株和其他植物吸收利用，所以全氮含量较高，撂荒后不再施肥，枯落物和死亡根系增加的氮不足以支持植物的吸收利用，故全氮含量逐渐降低。同时，研究区土壤为砂质壤土，氮在土壤中的转化和移动性较强，土壤中的氮可能随着雨水流失或通过反硝化作用转化损失到空气中[21]。土壤NH4+-N 和NO3--N 是植物吸收利用的主要氮形态，随着撂荒年限的增加，NH4+-N 和NO3--N 呈非线性变化，与以往研究一致[22]。

3.2 撂荒枸杞园土壤细菌多样性与组成变化

由于退耕第1年枸杞园耕作施肥等管理措施才停止，当时土壤退化较严重，短期内还未得到明显恢复，所以撂荒第1年土壤细菌多样性指数仍较低。此后，伴随大量草本植物入侵，根系分泌物增多，增加了土壤中有机质和养分的含量，为利用这些物质的细菌群落代谢和合成提供了养分来源，直接或间接促进微生物群落多样性发展[19,23]，所以土壤细菌多样性指数逐渐增大。到撂荒第4年时，适应性强的草本植物逐渐变为优势种群，其他植物逐渐消失，植物群落多样性减少，间接引起表层土壤中细菌群落多样性减小，但表下层受根系分布、土壤温度、湿度、呼吸等因素的影响，对植物群落的变化反馈较慢[24]，故表下层土壤多样性指数仍高于撂荒第3年。本研究土壤Proteobacteria 和Acidobacteriota 的相对丰度表现为撂荒初期高于撂荒后期，这可能与Proteobacteria 和Acidobacteriota属于寡营养型反硝化微生物有关，它们在养分有效性较低的环境中反而具有较高的相对丰度[25]；而Chloroflexi 和Actinomycetes 属于富营养型反硝化细菌门[26]，处于撂荒后期群落具有充足的有效养分，因此撂荒后期相对丰度较高。撂荒第2年Sphingomonas 和Lysobacter 数量较第1年急剧增加，但Bacillus 急剧减少。以往研究表明，Sphingomonas 能促进芳香族化合物的降解，对于保护环境具有潜在的应用价值[27]，Hymenobacter 严格耗氧，具有多种植物促生特性[28]，撂荒后这两种属的数量显著增加，说明撂荒后土壤呼吸显著增强[25,29]；撂荒土壤Limnobacter 和Cavicella 数量比对照高8.97 倍和6.24倍，这两种属都是有机污染物降解菌/多环芳烃（PAHs）降解菌[28,30]；Bacillusa 具有较高的抗逆性，能够在环境恶劣的条件下存活[23]，撂荒第2年后土壤有机质和养分都逐渐增加，土壤环境逐步改善，所以Bacillus 减少，这都是撂荒能够逐渐提升地力的证据。

3.3 枸杞园撂荒过程中土壤理化性质与细菌群落的关系

土壤理化性质是土壤细菌群落结构组成门变化的主要影响因子[31]。Tajik 等[32]开展了伊朗北部森林生态系统中土壤理化性质与土壤微生物之间的关系研究，结果表明土壤有机质、pH值、电导率和全氮均会对土壤微生物适宜习性有显著影响。本研究中，土壤水分、pH 与Cyanobacteria、Bacteroidota、Acidobacteriota 和Actinobacteriota 呈显著或极显著相关关系，说明pH 是影响土壤细菌组成的关键因子[31]。在已有报道中，Proteobacteria 被认为与碳利用有关，是世界上最为普遍的菌门[31]，Acidobacteriota 与土壤养分有较强相关性[33]，本研究也证实了这些结论。Lauber 等[34]研究指出酸性土壤Bacteroidota与土壤pH 呈显著正相关，而本研究结果显示Bacteroidota 与pH 呈显著负相关，这是由于研究区土壤属于碱化土壤，与李晶晶和续勇波[35]等在碱化土壤上的结论一致。Na 等[36]等研究发现，土壤有效磷含量是影响连作枸杞非根际土壤细菌群落的主要因素，本研究中多个优势菌门与有效磷都呈极显著相关关系，说明土壤有效磷对撂荒枸杞园土壤细菌群落也有显著影响[37]。整体来讲，在本研究土壤理化性状中，全氮、含水率、速效磷、速效钾、NO3--N 与细菌群落相关性更强。说明枸杞园撂荒过程中对土壤细菌群落而言，土壤水分和养分是其主控因素。

4 结 论

（1）枸杞园撂荒能够显著增加0～40 cm 土层含水量、有机质和碱解氮含量，降低含盐量、全氮、NH4+-N 和NO3--N 含量。撂荒年限越长，0～20 cm 土层有机质、碱解氮、速效磷含量越高，全氮含量越低。

（2）撂荒前3年，表层土壤细菌多样性指数逐渐增大。撂荒后土壤优势菌门 Proteobacteria、Acidobacteriota 和Nanoarchaeota 相对丰度分别比撂荒前增加15.19%、28.38%和53.11%，Bacteroidota、Actinobacteriota 和Cyanobacteria 相对丰度分别减少26.72%、40.09%和46.13%。不同撂荒年限、不同土层优势菌门相对丰度差异也较大。

（3）在属水平上，与对照相比，撂荒园土壤有益菌Hymenobacter、Limnobacter 和Cavicella 数量显著增加，而Candidatus_Methylomirabilis 和病原菌Flavisolibacter 等显著降低，说明撂荒后土壤细菌群落向着有益菌数量增多、病原菌数量减少的良好态势变化。

（4）宁夏老龄枸杞园在撂荒过程中土壤全氮、含水量、速效磷、速效钾和NO3--N 与土壤细菌群落多样性及优势菌门相对丰度相关性较强。