貉源致病性沙门菌的分离鉴定及耐药性检测

刘勃兴，赵安奇，张雪佳，王利丽，吴同垒，史秋梅，张志强

（河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，秦皇岛 066004）

沙门菌（Salmonella）为一种无芽孢革兰氏阴性杆菌，属于肠杆菌成员，可感染多种动物发病，也是引起人食物中毒的主要病原之一[1]。沙门菌可通过带菌动物、被污染的水和饲料等传播，威胁多种动物和人的公共卫生安全。貉感染沙门菌主要表现为肠炎与败血症，临床症状有腹泻，发热，体重减轻，母畜流产等，对貉的健康养殖造成严重危害[2-3]。研究表明，沙门菌的致病力是由众多毒力基因相互作用的结果，并且相关基因主要分布于菌毛、毒力岛、毒力质粒等，对毒力因子的研究是阐明沙门菌的致病机理关键[4-5]。目前，国内外细菌所致疾病的防治仍以抗生素类药物为主，但近年来，致病性沙门菌的耐药性日益严重，致使许多动物疾病无法有效治疗，因此，急需对致病性沙门菌的耐药性和耐药机制进行调查研究。

本研究从秦皇岛毛皮动物养殖场病死貉病料中分离沙门菌，并对其致病性和耐药性进行调查。

1 材料与方法

1.1 病料来源 本研究从秦皇岛毛皮动物养殖场收样107只病死貉，在实验室中无菌采取肝脏、心脏、脾脏等实质器官。

1.2 试验动物 70只昆明小鼠（体重20±5 g）购自北京维通利华试验动物有限公司。

1.3 主要试剂 HE琼脂培养基购自青岛海博生物公司；革兰氏染色液购自京博奥拓达科技有限公司产品；药敏纸片购自杭州天和微生物科技股份有限公司；ID32E肠杆菌科和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂条购自法国梅里埃公司产品；D2000 plus DNA marker购自中科瑞泰科技有限公司；2×TaqMaster Mix、细菌DNA基因组提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；PCR扩增引物合成和序列测定服务均由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.4 细菌的分离鉴定

1.4.1 细菌的分离纯化 采用文献[6]中的方式，将病料用接种环接种致HE琼脂培养基中，置于37℃恒温培养12～18 h。挑取中心有黑点且颜色呈蓝绿色的菌落接种于LB培养基，于37℃恒温摇床培养12～18 h。

1.4.2 分离菌的革兰氏染色 按照革兰氏染色液说明书对分离菌染色，用显微镜油镜观察。

1.4.3 分离菌的生化鉴定 生化鉴定试验按照ID32E肠杆菌科和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂条说明书操作，用ATB自动生化鉴定系统对结果进行判定。

1.4.4 分离菌的16S rDNA鉴定 合成16S rDNA通用引物，引物序列为27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT。用细菌DNA基因组提取试剂盒提取分离菌的DNA作为PCR模板。PCR完成后将PCR产物送至生工生物工程（上海）有限公司测序，测序结果用NCBI的BLAST分区检索并比对分析。

1.5 分离菌的致病性试验 参照参考文献[6]的方法，以小鼠为动物模型致病性试验。将纯化后的菌液以1∶100的比例转接至LB培养基，37℃恒温培养18 h，离心弃上清液，用无菌的PBS缓冲液重悬并调整菌液浓度为1×107CFU/mL。每株沙门菌为一个感染组，每组5只小鼠，腹腔注射0.1 mL调整浓度后菌液。设置对照组1组，5只小鼠，每只小鼠分别注射0.1 mL无菌PBS。观察各组小鼠状态，记录小鼠发病及死亡情况，剖检死亡小鼠，分离实质器官细菌并鉴定。

1.6 分离菌的毒力基因检测 参考文献[7-8]合成沙门菌的毒力基因引物（表1）。以提取的分离菌的DNA作为模板进行PCR，检测分离菌的毒力基因携带情况。

表1 沙门菌毒力基因引物序列Table 1 Primer sequence of Salmonella virulence gene

1.7 分离菌的药物敏感性试验 采取KB纸片法进行药物敏感性试验检测分离菌对15种兽医临床常用药的敏感性，试验操作以及判定标准参照美国临床和试验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）标准。试验的抗生素分别为：β-内酰胺类（氨苄西林、头孢曲松、阿莫西林），氨基糖苷类（阿米卡星、新霉素、卡那霉素），四环素类（多西环素、土霉素），氟喹诺酮类（环丙沙星、恩诺沙星），氯霉素类（氟苯尼考），大环内酯类（替米考星），磺胺类（磺胺间甲氧、磺胺二甲氧、复方新诺明）。

2 结果

2.1 细菌的分离鉴定 将107份病料接种于HE琼脂培养基，共分离到13株细菌。革兰氏染色结果显示，13株分离菌为革兰氏阴性小杆菌。细菌的生化鉴定结果经ATB自动生化鉴定系统判定，13株分离菌为沙门菌，符合率为99.7%～99.9%，符合《伯杰氏细菌鉴定手册》中沙门菌的生化特性。16S rDNA鉴定结果显示，13株菌与NCBI中报道的沙门菌属参考菌株同源性最高，同源率为99%～100%。

2.2 分离菌的致病性试验 感染小鼠后，对各组小鼠持续观察2周。感染组小鼠出现呼吸急促、紊乱，精神状态萎靡。各感染组小鼠死亡情况见表2，剖检死亡小鼠，小鼠肝脏、肺脏等器官有明显出血点、淤血，脾脏肿大，腹腔出血，有积液。对照组小鼠无死亡，状态良好，无病征。分离感染组死亡小鼠肝脏、肺脏、脾脏等器官细菌，经鉴定为沙门菌，生化鉴定等鉴定结果与感染菌株特征相近。

2.3 分离菌的毒力基因检测 毒力基因检测结果显示，13株沙门菌分别检出3～7个毒力基因，具体见表2。19种毒力基因中，未检出fimA、sseC、sseL、inaV基因，其余15种毒力基因均有检出，各基因检出率见图1。spv R基因检出率最高，为69.23%（9/19）。

图1 分离菌的菌落形态和革兰氏染色结果Fig.1 Colony morphology and Gram staining results of isolated bacteria

表2 13株分离菌的毒力基因检测结果与小鼠死亡情况Table 2 Virulence gene test results of 13 isolates and death in mice

图2 13株分离菌各毒力基因检出率Fig.2 Detection rate of virulence genes of 13 isolates

2.4 分离菌的药物敏感性试验 13株沙门菌的药物敏感性试验结果显示（表3和图3），13株沙门菌分别对5～14种抗生素耐药，对土霉素、替米考星、磺胺二甲氧嘧啶、复方新诺明耐药率高达100%（13/13），对阿米卡星敏感率最高，为53.85%（7/13）。

图3 13株分离菌的耐药情况Fig.3 Drug resistance of 13 isolates

3 讨论

近年来，我国毛皮动物养殖规模和密度日益增加，相关疾病的报道也逐渐增加，其中，细菌病占据较大比重[9]。在国内，在河北省乐亭县、山东省、黑龙江省铁力市等均报道沙门菌感染貉发病死亡的病例[3,10-11]。在本研究中，从秦皇岛市的107份貉病料中分离出13株沙门菌，分离率为12.15%，并通过小鼠致病性试验发现分离菌株均具有一定的毒力，说明沙门菌是致貉发病死亡的重要病原。

毒力因子在沙门菌感染发病过程中有重要的作用，因此，本研究用PCR方法检测13株沙门菌的毒力岛、毒力质粒、菌毛等共计19种毒力基因的携带情况。结果显示，spv相关基因（spvR、spvA、spvB、spvC、spvD）检出率较高。spv是沙门菌毒力质粒（Salmonellaplasmid virulence,spv），大小为50～90 kb，有6个开放阅读框（open reading frame,ORF）组成，包括正性调控基因spvR，spvA、spvB、spvC、spvD4个效应基因和orfE基因[12]。spv基因与沙门菌的粘附、定殖和血清抗性等毒力表型有关，是沙门菌在巨噬细胞生存的必需基因[13]。本研究中，秦皇岛地区貉源沙门菌spv基因检出率较高，表明在该地区spv基因在分子水平上较为流行，值得进一步探讨研究spv与貉源沙门菌致病性之间的关系。

沙门菌存在多种耐药机制，如靶位基因突变，酶解作用，药物外排，质粒、转座子、整合子介导的耐药等，并且可通过多种方式从环境中获得耐药性[14]。沙门菌复杂的耐药性产生机制以及抗生素类药物的滥用等原因导致沙门菌耐药情况日益严重[15]。本研究中，13株沙门菌分别对5～14种抗生素耐药，其中10株对10种及以上抗生素耐药，对土霉素、替米考星、磺胺二甲氧嘧啶、复方新诺明耐药率高达100%，耐药情况较为严重。孙娜等[16]分离的狐源沙门菌对头孢类药物、左氧氟沙星和多粘菌素较敏感，对氨基糖苷类药物、四环素、氨苄西林、诺氟沙星、环丙沙星和氯霉素全部表现为耐药。王海龙等[17]分离的水貂源沙门菌对环丙沙星、左旋氧氟沙星、克林霉素、头孢曲松钠高敏，对丁胺卡那霉素、氨苄西林、庆大霉素低敏。多组数据显示，毛皮动物沙门菌的耐药性普遍存在，耐药情况较为严重，并且不同来源的沙门菌耐药情况不同，因此，在临床治疗过程中应注意合理应抗生素，并应根据致病菌株对抗生素的敏感情况筛选出最适药物进行治疗。

本研究从秦皇岛地区病死貉分离出13株沙门菌，分离到的菌株对小鼠具有不同程度的致病性，且分离spv毒力基因检出率较高，通过药物敏感性试验发现分离菌株具有严重的耐药性。本研究为秦皇岛地区由沙门菌感染所致貉相关疾病的研究提供参考。