猪骨髓源巨噬细胞的分离和培养

江 珊 ，虞凌雪 ,2，于 海 ，姜一峰 ，李国新 ，刘长龙 ，周艳君 ，高 飞 ，赵 款 ，张玉娇 ，曹云雷，白渊哲，童光志,2

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2.扬州大学 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009）

巨噬细胞是最早接触病原微生物的免疫防御细胞之一，具有多种生物学功能，是宿主天然免疫和特异性免疫的重要执行者[1]。巨噬细胞在非特异性免疫中，可通过吞噬作用杀灭及清除病原体和异物介导炎症反应，参与先天性免疫应答；在特异性免疫中，作为抗原递呈细胞加工和递呈抗原并启动获得性免疫应答，同时可分泌细胞因子发挥免疫调节作用[2]。病毒可通过感染巨噬细胞，阻遏巨噬细胞吞噬作用、抑制抗原呈递能力和调节促炎症细胞因子的产生，影响宿主的获得性免疫应答，并且不同分化状态下的巨噬细胞对病毒的易感性不同[3]。因此研究骨髓源巨噬细胞对病毒研究至关重要。

巨噬细胞是一种可塑性强且功能多样性的细胞群体，是免疫反应中的关键调节及效应细胞，它的极化是微环境信号刺激从而获得不同表型和功能特征的过程，目前普遍采用的体外获得巨噬细胞的手段是骨髓单核细胞经M-CSF培养形成的[4]。巨噬细胞活化包括两种途径：经典活化途径和选择性活化途径。经典活化的M1型巨噬细胞由IFN-α及脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）刺激而来，其特征是分泌Th1相关细胞因子IL-12、IL-6、IL-1、TNF-α，参与机体炎症反应，呈现出较强的抗原递呈及吞噬能力[5]；而IL-4/IL-13驱动M2型巨噬细胞极化，分泌Th2相关因子IL-10等，可减轻局部炎性反应，促进组织修复能力[6]。根据刺激因子不同，可将M2型巨噬细胞进一步细化为M2a（IL-4和IL-13诱导）、M2b（通过免疫复合物和TLR或IL-1R激动剂诱导）及M2c巨噬细胞（由IL-10诱导），M2a和M2b发挥免疫调节功能并驱动Th2型反应，M2c与抑制免疫反应和组织修复相关[7]。

巨噬细胞是许多猪源性病毒靶向的主要细胞，而骨髓源巨噬细胞由于其在机体分布广泛且可塑性较强因此相比较于肺泡巨噬细胞有更高的潜在研究意义[8]。目前对猪骨髓源巨噬细胞及其亚型的培养研究还不深入，建立起成熟的培养方法及分化手段能对今后病毒机制研究打下基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂、仪器及耗材 实验中涉及到的PBS、胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、1640培养基、胰酶均购自Gibco公司，PrimocinTM原代细胞抗生素购自Invivogen公司；红细胞裂解液购自Biosharp公司；M-CSF、LPS、IFN-γ和IL4均购自美国R&D公司；pHrodoTMGreen zymosan A BioParticlesTMconjuage购自Invitrogen公司；DCFH-DA购自Sigma公司。

1.2 实验动物 本实验所用的试验动物为15日龄健康仔猪，经检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒Ⅱ型均阴性。

1.3 猪骨髓细胞的分离培养 我们选取15日龄健康仔猪的股骨及胫骨，剔除表面组织，在操作时小心勿将骨膜划破以免后期冲洗时污染。将处理好的骨置于75%酒精中浸泡5 min，随后转至超净台中用无菌PBS冲洗，借助骨钳截去骨两端，穿刺针插入两端以便冲洗。用20 mL针管吸取包含10%血清及1%抗生素的1640培养基冲洗骨髓，骨的两端各冲洗一次至50 mL离心管中，于低温水平离心机4℃、550 ×g离心6 min，弃掉上清液。培养基冲洗两遍后4℃、550 ×g离心6 min弃上清液，5 mL红细胞裂解液裂解5 min，期间每隔两分钟颠倒混匀几次，4℃、550 ×g离心6 min，培养基洗两遍弃掉上清液后，离心的细胞1%primocin抗生素+10%FBS+100 ng/mL M-CSF的1640培养基重悬成单细胞悬液。重悬的细胞以2×107的密度铺于100 mm平皿中，3 d后换培养基，6～7 d后于倒置显微镜下观察细胞形态。经M-CSF诱导培养的BMDM以每孔2×106细胞铺于6孔板中，以1 μg/mL LPS及100 ng/mL IFN-γ共刺激，可将巨噬细胞分化成M1亚群；选取100 ng/mL IL-4诱导BMDM形成M2型巨噬细胞。

1.4 吞噬实验 将M0、M1、M2型骨髓源巨噬细胞以每孔1×106细胞铺于6孔板中，培养过夜后无菌PBS冲洗两遍，FITC conjugated zymosan bioparticles（Molecular Probes）以1 mL/106细胞的比例加入后在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，同时以在4℃进行同样操作作为阴性对照。孵育1 h后，PBS洗两遍，通过流式细胞仪检测绿色荧光强度来说明细胞吞噬能力。

1.5 ROS检测 将M0、M1、M2型骨髓源巨噬细胞以每孔1×106细胞数铺于6孔板中，过夜培养后PBS冲洗两遍，加入20 μmol/L DCFH-DA在37℃的5%CO2培养箱中孵育30 min，随后PBS洗3次，消化重悬，通过流式细胞仪分析平均荧光强度。

2 结果

2.1 细胞形态学观察 选取15日龄的健康仔猪的骨髓干细胞（bone marrow stem cell, BMHC），在含M-CSF 100 ng/mL的RPMI 1640培养液的诱导条件下进行体外贴壁培养，6～7 d时获得纯度较高的M0型骨髓源巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophage,BMDM），随后通过LPS、IFN-γ共同刺激将巨噬细胞分化成M1亚群、IL-4等极化得到M2型巨噬细胞。在倒置显微镜下观察可见M-CSF活化第1 d巨噬细胞贴壁状态不明显，培养6 d后巨噬细胞状态更好，贴壁更牢固，而极化后M1、M2型骨髓源巨噬细胞与未极化的M0型相比更大、更平坦、颗粒状更明显，且相较于M1型，M2型巨噬细胞长有小的触角及伪足（图1）。

图1 骨髓巨噬细胞亚群形态观察Fig.1 Morphology observation of polarized Bone marrow-derived macrophages

2.2 吞噬实验 为鉴定巨噬细胞分化状态，我们进行了吞噬实验，将分化的巨噬细胞与带FITC荧光标记的酵母颗粒相互作用，在37℃培养条件下巨噬细胞的吞噬作用较强，可以吞噬颗粒并在荧光显微镜下观察到荧光，而对照组4℃条件下巨噬细胞活性弱且吞噬能力较弱。经显微镜观察到在37℃培养条件下的巨噬细胞M0、M1、M2都表现出较强的荧光水平，通过流式细胞术分析可知，与对照相比，各样品阳性细胞数所占比例显著性提高，表明分化的巨噬细胞纯度较高，具有吞噬功能（图2）。

图2 巨噬细胞亚群吞噬活性鉴定Fig.2 Phagocytic activity of pig bone marrow-derived macrophages

2.3 细胞内活性氧（Reactive oxygen species, ROS）的检测 为了检测活化的骨髓源巨噬细胞各亚群细胞活性氧的变化，将DCFH-DA与分化后巨噬细胞亚群相互作用，通过流式细胞仪检测选定阳性区域的绿色荧光强度以显示不同亚群中的ROS水平，发现较M0型巨噬细胞，分化后的M1及M2型FITC平均荧光强度都有所提升，这表明在分化后细胞内的活性氧分泌增加，如图3所示。

图3 骨髓巨噬细胞的ROS含量检测Fig.3 Intracellular reactive oxygen species of pig bone marrow-derived macrophages

3 讨论

单核源巨噬细胞及骨髓源巨噬细胞在微环境刺激条件下能经历特定的活化途径，包括经典活化途径的M1型巨噬细胞及选择性活化的M2型巨噬细胞。体外研究表明，IFN-γ、LPS和IL-4诱导可分别诱导M1型和M2型极化[9-10]。本实验通过形态学观察发现分化后的巨噬细胞与未分化M0型巨噬细胞相比细胞更大且呈颗粒状。同时，M1、M2型巨噬细胞在表型上有一定差异，主要体现在M2型巨噬细胞有更多细小的伪足。

巨噬细胞最主要的生物学特性是具有强大的吞噬能力，我们在鉴定中采用酵母颗粒的吞噬实验来验证巨噬细胞的吞噬功能，发现所有分化的M1、M2型巨噬细胞都有吞噬作用。活性氧自由基包括有机氧化物、臭氧、单体氧和过氧化物等，线粒体氧化呼吸过程释放的ROS是细胞内源性ROS的主要来源。单核巨噬吞噬细菌或其他病原后，分布在其胞膜的氧化酶引起大量活性氧的产生，是形成内源性ROS的另一来源[11]。细胞内活性氧（ROS）被认为是胞内第二信使，主要参与转录因子NF-κB激活和靶基因调控等[12-13]。本研究表明，LPS和IFN-γ共同诱导M1型巨噬细胞极化和IL-4诱导M2型巨噬细胞极化，虽然分化方向不同，但均有ROS的增加。M1型和M2型巨噬细胞的激活过程中涉及了多种转录因子的活化调控，其中ROS发挥的作用机制尚不明确[9-10]。

综上所述，本研究采用重组表达蛋白M-CSF对骨髓干细胞进行体外诱导培养，在短时间内可以获得大量的贴壁细胞，通过形态学观察、吞噬实验和细胞活性氧ROS检测验证所培养的贴壁细胞是高纯度、高活性的骨髓源巨噬细胞，为进一步研究巨噬细胞的生物学功能奠定了基础。