以鸡胚为宿主针对冠状病毒消毒效果评估模型的建立及培养特性

陈 卓，冯敬敬，刘爱玲，马利芳，牛登云，孟小宾，陈家锃

（天津渤海农牧产业联合研究院有限公司，天津 300308）

冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科、冠状病毒属，于1937年从鸡身上分离得到[1]。冠状病毒通过呼吸道分泌物排出体外，经口液、喷嚏、接触传染，并通过空气飞沫传播，是许多家禽家畜、宠物包括人类疾病的重要病原，可引起多种急慢性疾病[2]。在对冠状病毒的各种预防和控制措施中，消毒是切断传播途径重要措施之一[3]。禽传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）属于冠状病毒科、γ冠状病毒属[4]。美国环境保护署（environmental protection agency, EPA）已推荐IBV为SARS病毒的替代病毒用于病毒灭活试验[5]。由于冠状病毒存在传染性危险，因此本实验利用IBV H120株作为指示病毒，是一种合理的替代试验方式[6]。本研究利用IBV作为替代病毒用于消毒试验研究[7]，评估六种消毒剂对冠状病毒的杀灭效果，为临床应用提供依据。

市面上消毒剂种类繁多，消毒原理和作用也大不相同，根据消毒剂的化学性质，一般将其分为酚类、碱类、醛类、季铵盐类、含氯制剂、含碘制剂、过氧化物类、醇类[8-9]。如何正确的选择和使用消毒剂成为一个实际问题。本研究建立的消毒剂评估模型为如何正确选择消毒剂提供了参考。

1 材料和方法

1.1 鸡胚、毒株、待测消毒剂及生化试剂 9～10日龄鸡胚购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司；毒株选择纯净IBV H120株（EID50=10-7.0/0.1 mL），由天津瑞普生物空港基地实验室制备；过硫酸氢钾复合物粉（瑞普生物，批号为20191005，有效氯不少于10%），月苄三甲氯铵（瑞普生物，批号为20200112，10%），戊二醛癸甲溴铵溶液（瑞普生物，批号20190814，戊二醛5 g+葵甲溴铵5 g/100 mL），二氯异氰脲酸钠粉（内蒙古瑞普大地，批号为190201，有效氯20%），消毒剂84（捷力达，批号为20190901，有效氯≥4.5%），75%酒精（利尔康，批号为20190610）；PCR所用试剂均购自TaKaRa公司。

1.2 鸡胚法消毒效果评估模型建立

1.2.1 消毒剂对鸡胚的最大无毒浓度的测定 将消毒剂按照100倍梯度采用无菌PBS稀释后与无菌PBS等量混匀后，取200 μL尿囊腔接种9～10日龄鸡胚，摸索消毒剂对鸡胚的最大无毒浓度。每种消毒剂稀释8个梯度（1∶5、1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶800），每个稀释梯度接种3枚鸡胚；同时将200 μL无菌PBS经尿囊腔接种3枚9～10日龄鸡胚作为空白对照。接种后置于孵化器中培养72 h、24 h内死亡的胚忽略不计，记录鸡胚死亡情况。24 h后死亡胚和72 h活胚逐个解剖观察消毒剂对鸡胚有无损伤，记录消毒剂对鸡胚的最大无毒浓度。

1.2.2 消毒剂最大有效稀释度测定 将上述测定的消毒剂最大无毒浓度作为起始浓度，将病毒液稀释成1000 EID50、500 EID50、200 EID50。用无菌PBS将消毒剂进行100倍梯度稀释，稀释后加入等体积稀释后病毒液，涡旋30 s进行充分混匀，于室温下静置30 min使消毒剂与病毒液充分作用。取以上反应物200 μL尿囊腔接种9～10日龄鸡胚，每个稀释度接种3枚鸡胚，同时将200 μL无菌PBS尿囊腔接种3枚9～10日龄鸡胚作为空白对照。将接种鸡胚置于孵化器中培养72 h。待实验结束后，24 h内死亡的胚忽略不计，24 h以后死亡的鸡胚单独收获尿囊液，72 h未死亡的鸡胚，每个稀释度的鸡胚尿囊液收集于同一个无菌的EP管中。将收获的尿囊液进行病毒RT-PCR实验，鉴定是否有病毒存在。

1.2.3 消毒剂最短有效感作时间测定 根据上述实验测得的消毒剂起始浓度和最大有效稀释度，取二者中浓度作为此次消毒剂的作用浓度，用无菌PBS将消毒剂稀释到该浓度。将病毒液稀释成1000 EID50、500 EID50、200 EID50。将稀释好的消毒剂与病毒液等体积混合，涡旋30 s进行充分混匀，于室温下分别静置5 min、10 min使消毒剂与病毒液充分作用。取以上反应物200 μL尿囊腔接种9～10日龄鸡胚，每个稀释度接种3枚鸡胚，同时将200 μL无菌PBS尿囊腔接种3枚9～10日龄鸡胚作为空白对照。将接种鸡胚置于孵化器中培养72 h。待实验结束后，24 h内死亡的胚忽略不计，24 h以后死亡的鸡胚单独收获尿囊液，72 h未死亡的鸡胚，每个稀释度的鸡胚尿囊液收集于同一个无菌的EP管中。将收获的尿囊液进行病毒RT-PCR实验，鉴定是否有病毒存在。

2 结果

2.1 消毒剂对鸡胚的最大无毒浓度结果分析 根据实验结果显示，过硫酸氢钾复合物粉、84消毒剂在1∶5倍稀释时出现死胚，故两种消毒剂最大无毒浓度均为1∶10倍稀释，月苄三甲氯铵、戊二醛癸甲溴铵溶液、二氯异氰脲酸钠粉在1∶50倍稀释时出现死胚，故三种消毒剂最大无毒浓度均为1∶100。阴性对照成立。具体结果见表1。

表1 消毒剂最大无毒浓度结果分析Table 1 Analysis of the results of the maximum non-toxic concentration of disinfectant

2.2 消毒剂最大有效稀释度结果分析 根据实验结果显示，在与病毒液感作30 min后，过硫酸氢钾复合物粉的杀灭效果最好，在1∶8000倍稀释后仍能杀灭IBV；其次为二氯异氰脲酸钠和月苄三甲氯铵，在1∶4000和1∶3200倍稀释后仍能杀灭IBV。对照组成立。详细结果见表2。

表2 消毒剂最大有效稀释度结果分析Table 2 Analysis of the results of maximum effective dilution of disinfectants

（接上表）

2.3 消毒剂最短有效感作时间结果分析 根据实验结果显示，过硫酸氢钾复合物粉1∶4000倍稀释、二氯异氰脲酸钠1∶2000倍稀释、84消毒剂1∶600倍稀释后可在5 min内完全杀灭IBV，10%月苄三甲氯铵1∶1600倍稀释、戊二醛癸甲溴铵溶液1∶1300倍稀释后可在10 min内完全杀灭IBV。75%的酒精杀灭病毒所需时间最长。详细结果见表3。

表3 消毒剂最短有效作用时间结果分析Table 3 Analysis of the results of the shortest effective time of disinfectants

3 讨论

在各种预防和控制措施中，做好消毒是切断传播途径重要措施之一。消毒措施不应该盲目进行，应科学合理进行消毒。如何选择正确的消毒剂变得尤为重要。市面上消毒剂种类繁多，其产品的主要成分及复配成分不同，其杀灭效果有差异[10]。若消毒剂选用不当，不仅起不到消毒效果，还会进一步的影响生物安全。本研究建立了鸡胚法消毒效果评估模型，选择过硫酸氢钾复合物粉、10%月苄三甲氯铵、戊二醛癸甲溴铵溶液、二氯异氰脲酸钠粉（有效氯20%）、消毒剂84，以及75%酒精六种消毒剂进行消毒评估实验。从最大有效稀释度和最短有效感作时间这两个方面对这六种消毒剂进行评估实验。动物实验和鸡胚实验均属于活体实验，相比较动物实验，建立鸡胚法消毒效果评估模型，更加方便操作，容易观察，重复性好，经济，卫生，实验耗时短等优点[11]，可以更加方便快捷的运用于不同消毒剂的效果评估。

IBV属于冠状病毒属，是有包膜的RNA病毒，包膜具有亲脂性，因此对消毒剂的作用较敏感[12]，对含氯消毒剂、季铵盐类、醇类消毒剂均较敏感。根据实验结果显示，根据消毒剂最大有效稀释度结果分析，在与病毒液感作30 min后，过硫酸氢钾复合物粉的杀灭效果最好，在1∶8000倍稀释后仍能杀灭IBV；其次为二氯异氰脲酸钠和月苄三甲氯铵，在1∶4000和1∶3200倍稀释后仍能杀灭IBV。通过对最小有效感作时间的摸索，过硫酸氢钾复合物粉1∶4000倍稀释、二氯异氰脲酸钠1∶2000倍稀释、84消毒剂1∶600倍稀释后可在5 min内完全杀灭IBV；10%月苄三甲氯铵1∶1600倍稀释、戊二醛癸甲溴铵溶液1∶1300倍稀释后需10 min完全杀灭IBV；75%的酒精杀灭病毒所需时间最长。

84消毒液和二氯异氰脲酸钠粉虽杀灭效果较好，但均属于含氯消毒剂，有刺激性气味，有一定腐蚀性，会产生氯化消毒副产物，给氯化消毒带来了挑战和质疑。随着工艺技术发展，过硫酸氢钾复合物进入市场[13]。过硫酸氢钾复合物粉对人畜共患的几乎所有的细菌、真菌、病毒具有较好的杀灭作用。同时低毒，用途广泛、安全、绿色环保完美结合，具有良好发展前景[14]。过硫酸氢钾复合物是一种高效广谱、可靠持久、安全环境友好型的复合消毒剂，且不受低温、高温、水的硬度和pH值影响[15]，可在多种场景和复杂环境中保证消毒的可靠性。卫清宁（天津瑞普生物，过硫酸氢钾复合物，有效氯不少于10%）属于复合型含氯消毒剂，可快速灭活病毒，消毒效果稳定，7 d长效，安全环保，不腐蚀金属和活体。并于近日获天津卫健委批准，取得人用卫消字号。也属于国家卫生健康委要求紧急上市的含氯消毒剂[16]。2020年2月12日，中国疾控中心消毒首席专家、环境所消毒中心张流波主任，在《新闻1+1》关于冠状病毒如何消毒的直播访谈中，推荐使用季铵盐类消毒药用于新型冠状病毒进行消毒，又安全，又可靠。安立消（天津瑞普生物）主要成分为10%月苄三甲氯铵，属于季铵盐类消毒剂，季铵盐类消毒剂的特点是对皮肤黏膜无刺激，毒性小，稳定性好，对消毒物品无损害等[17]，在本研究中也证实其消杀冠状病毒效果较好。

本研究建立的鸡胚法消毒评估模型，以鸡传染性支气管炎为指示性病毒，该病毒操作时安全，鸡胚也易于获得，评价成本低，通过RT-PCR的方法的确认使得结果更加可信。虽然本研究得出的结果与国家卫健委推荐的消毒剂一致，但本研究还需要进一步与以标准物质为参考做平行比对实验，以便为消毒剂评估提供更多的数据支撑，有利于公共卫生事业的发展。