黄芪超微粉抗急性肝损伤、抗疲劳作用及黄芪甲苷含量的变化*

柴梦音 寇卜心 豆双双 刘晓霓**

(1.首都医科大学附属北京佑安医院，北京 100069；2.北京肝病研究所，北京 100069)

超微粉碎技术是利用机械或流体动力的方法，对固体物质进行撞击和研磨，进而克服固体物质内部凝聚力使之粉碎的技术，可以使物质的粒度达到10 μm以下，甚至达到1 μm的超微米水平[1-2]。超微粉碎技术是机械化学领域中发展较快的一种高新技术，广泛应用于食品、中药及化妆品领域[2]。中药超微粉是采用超微粉碎技术打破药材细胞壁，将中药材进行微粉化，增强中药的溶解性、吸附性和流动性,提高中药生物利用度、保持或提高中药药效，节约中药资源，提高传统中药剂型品质、促进中药标准化，是促进中药现代化的重要途径之一[3-8]。豆科植物蒙古黄芪AstragalusmembranaceusBge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao和膜荚黄芪A.membranaceus(Fisch.)Bge的根，具有补气固表、利尿脱毒、排脓、敛疮生肌的功效[9]。现代药理研究显示黄芪具有调节脂代谢及抗氧化损伤[10]、抗衰老[11]、增强免疫、清除自由基活性、抗肝纤维化等[12-13]作用。

本研究采用低温超微粉碎技术将黄芪饮片粉碎制成超微粉，采用小鼠急性肝损伤模型和游泳耐疲劳模型，评价黄芪超微粉保肝、耐疲劳的作用，并检测黄芪超微粉的黄芪甲苷的含量变化，为黄芪超微粉的应用提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1仪器 7600生化仪(日本日立)；DM750显微镜(德国莱卡公司)；TFCW-6B低温振动粉碎机(济南天方机械有限公司)；MS2000激光粒度仪(英国马尔文公司)；1200 series 高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Alltech ELSD 2000ES型蒸发光散射检测器(美国奥泰公司)；Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试剂 黄芪饮片(北京燕北饮片厂)；分析纯CCl4(北京化工厂)；乳酸试剂盒 (南京建成生物工程研究所)；AST和ALT测定试剂盒(北京利德曼生化股份有限公司)；黄芪甲苷对照品(批号：110781-201314，中国药品生物制品检定所)；色谱纯乙腈(美国Sigma公司)。

1.3实验动物 昆明种小鼠，SPF级，5～6周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号为SCXK(京)2016-0011，所有小鼠饲养于SPF独立通风饲养系统内，实验动物许可证号为SYXK(京)2020-0015。小鼠饲养采用12 h/12 h光照/黑暗条件，温度20～24 ℃，自由采食和饮水。

2 实验方法

2.1黄芪超微粉制备 黄芪饮片用低温振动粉碎机在-25 ℃低温条件下震动粉碎30 min后，冷冻保存待用。采用显微镜和激光粒度仪观察黄芪超微粉的显微表征和粒度表征。

2.2黄芪甲苷含量测定

2.2.1HPLC条件 流动相为乙腈和水，梯度洗脱(0 min，30∶70，V/V；10 min，30∶70；15 min，50∶50；18 min，60∶40；20 min，30∶70；30 min，30∶70)；进样量20 μL；流速1.0 mL· min-1，运行时间：30 min，柱温：25 ℃。ELSD检测器漂移管温度为95 ℃，氮气流速为2.6 L·min-1，增益为2。

2.2.2黄芪甲苷对照品储备液配制和标准曲线测定 精密称取黄芪甲苷，配制10 mL的0.5 mg·mL-1黄芪甲苷储备液。取一定量黄芪甲苷储备液，以流动相稀释，配制0.02，0.04，0.09，0.185和0.375 μg·mL-1浓度对照品溶液；每1梯度浓度溶液进样20 μL测定，重复1次，取平均值，以组分的峰高(A)为纵坐标，组分浓度(C，μg·mL-1)为横坐标，进行线性回归。

2.2.3黄芪超微粉样品中黄芪甲苷含量测定 取一定量黄芪饮片，研钵粉碎，称量0.5 g加50% 乙醇至9 mL；称量黄芪超微粉76.8 mg，加50%乙醇至4 mL；以上样品振荡器充分混匀后，60 ℃超声波清洗器中加热超声20 min，取出重复振荡器混匀，继续60 ℃超声波清洗器中加热超声20 min，重复3次，样品加盖密封过夜，次日测定样品溶液终体积，上清液氮气流挥干，流动相复溶，0.2 μm微孔滤膜过滤，20 μL HPLC进样测定黄芪甲苷含量，同一样品测定2次。

2.3给药剂量和方法 黄芪饮片和黄芪超微粉水煎制成干浸膏，用0.1%羧甲基纤维素钠制成混悬液。根据小鼠最大给药溶剂确定黄芪饮片和黄芪超微粉最大给药剂量为10 g·kg-1。

2.4对急性肝损伤小鼠的影响 5～6周龄昆明种小鼠60只，随机分为对照组(Con)、模型组(M)、黄芪饮片组(HQY，10 g·kg-1)、黄芪超微粉高剂量组(HQFH，10 g·kg-1)、黄芪超微粉中剂量组(HQFM，g·kg-1)、黄芪超微粉低剂量组(HQFL，0.4 g·kg-1)，每组10只，雌雄各半。除对照组和模型组，各药物组提前给治疗药7d，对照组给与相同体积生理盐水。末次给药后，模型组和各药物组腹腔注射0.1% CCl4橄榄油(10 mL·kg-1)，18 h后所有小鼠眼眶采血，分离血浆，进行肝功能指标检测，一部分肝脏组织固定用于HE染色观察肝脏损伤情况。

2.5对负重游泳小鼠的影响 5～6周龄昆明种小鼠60只，随机分为对照组(Con)、模型组(M)、黄芪饮片组(HQY，10 g· kg-1)、黄芪超微粉高剂量组(HQFH，10 g·kg-1)、黄芪超微粉中剂量组(HQFM，2 g·kg-1)、黄芪超微粉低剂量组(HQFL，0.4 g·kg-1)，每组10只，雌雄各半。每组提前给药7 d，将小鼠按照体重10% 负重后，将小鼠置入水中游泳(25 ℃)，并开始计时。当小鼠沉入水中不再浮出水面5 s，停止计时，计算小鼠游泳时间，实验结束后小鼠眼眶取血，检测血中乳酸含量。对照组不进行游泳，但给与生理盐水，实验终点取血检测乳酸含量。

2.6统计学方法 采用SPSS软件多因素方差分析进行数据处理，数据采用平均值±标准差进行表示，P<0.05 表示为具有显著性意义。

3 实验结果

3.1黄芪超微粉的显微和粒度表征 显微镜下可见黄芪饮片被粉碎成大小不等的细小颗粒，大部分颗粒小于80 μm(图1A)。超微粉黄芪超微粉粒径分布范围为0.45～709 μm，D10为3.235 μm，D25为7.219 μm，D50为17.559 μm，D75为63.890 μm，D90为140.794 μm。小于80 μm的颗粒累积大于80%(图1B)。这些结果提示，黄芪饮片经过超低温粉碎后大部分颗粒为超微粉的粒径范围，已经超微粉化。

A.黄芪超微粉显微表征；B.黄芪超微粉粒度表征

3.2对急性肝损伤小鼠的影响 与对照组相比，腹腔注射1% CCl4没有造成小鼠明显体重下降。无论是与对照组还是模型组相比，各治疗组小鼠的体重变化无显著性差异，提示小鼠对黄芪饮片和各超微粉均耐受(图2A)。肝脏指数结果显示：1% CCl4可以引起肝脏肿大，肝脏重量增加，与对照组相比肝脏指数增加(P<0.05)；与模型组相比，黄芪饮片和各黄芪超微粉组小鼠的肝脏指数明显降低(P<0.05)，但各治疗组之间无差异(图2B)。HE结果显示，1% CCl4可以造成小鼠急性肝损伤，镜下可见成片的肝坏死灶。与模型组相比，黄芪饮片及各剂量黄芪超微粉组小鼠肝坏死明显减少(图 2C)；与对照组相比，模型组的AST，ALT明显升高(P<0.05)，而黄芪饮片及各黄芪超微粉可以明显降低CCl4所致的AST，ALT的升高(P<0.05)，提示黄芪饮片和黄芪超微粉具有保护肝损伤的作用(图 2D)。值得研究的是，黄芪饮片和各黄芪超微粉组在保护肝损伤时没有显著差异，0.4 g·kg-1的小剂量组的保护作用与其它治疗组无异，提示采用黄芪超微粉很低的剂量就可以有明显的保肝CCl4所致的肝损伤作用。

A.黄芪超微粉对小鼠体重的影响；B.黄芪超微粉对小鼠肝脏指数的影响；C.HE染色显示黄芪超微粉对小鼠肝脏损伤的影响(×200倍)；D.黄芪超微粉对小鼠肝脏功能的影响。与对照组相比，*P<0.05;与模型组比较，△P<0.05

3.3对负重游泳小鼠耐疲劳的影响 小鼠游泳实验显示：与对照组相比，黄芪各超微粉组以及黄芪饮片组游泳时间明显延长(P<0.05)，以黄芪超微粉高剂量组最为显著，各治疗组之间没有显著性差异(图3A)。小鼠血中乳酸含量结果显示：与对照组相比，模型组小鼠乳酸含量明显增加；与模型组相比，黄芪超微粉各剂量组以及黄芪饮片组乳酸含量明显降低。各黄芪超微粉组游泳时间和乳酸含量没有显著差异(P<0.05)(图3B)。这些结果提示黄芪超微粉具有对抗小鼠疲劳的作用。

A.黄芪超微粉对小鼠游泳时间的影响；B.黄芪超微粉对小鼠血中乳酸含量的影响。与对照组相比，*P<0.05;与模型组比较，△P<0.05

3.4黄芪超微粉中黄芪甲苷含量测定 黄芪甲苷对照品的高效液相保留时间为14.388 min。黄芪甲苷回归方程：Y=3377.4X+24.215(r=0.9998)，表明黄芪甲苷在0.02～0.375 μg·mL-1浓度范围内具有较好的线性关系，最低检测限为0.02 μg·mL-1，HPLC信噪比≥3，黄芪甲苷回收率良好，仪器精密度及重现性符合HPLC含量测定要求。黄芪超微粉和黄芪饮片样品的黄芪甲苷的峰分离较好(图4)。黄芪超微粉和黄芪饮片样品的黄芪甲苷含量分别为0.792±0.053%和0.495±0.041%，黄芪超微粉中黄芪甲苷的含量是黄芪饮片中黄芪甲苷含量的1.6倍，提示黄芪超微粉更易于溶出黄芪甲苷。

A.黄芪甲苷对照品；B.黄芪饮片；C.黄芪超微粉

表1 黄芪饮片和黄芪超微粉中黄芪甲苷含量比较

4 讨论

中药超微粉，粒径一般在1～75 μm之间，在保持传统中药药效学物质基础的同时，其最大的优势就是大大提高了药物的吸收和生物利用度，减少了药物用量，缩短了药物起效时间[14]，给传统中药带来了巨大的改变，在改善剂型、完善中药炮制、开发中药新剂型等方面具有广阔的发展空间[15-18]。中药超微粉碎加工技术除了应用于药材、饮片加工外，还可对中药提取物微粉化，尤其对难溶性提取物微粉化有着更重要的意义。中药超微粉碎技术将对中药行业产生新一轮技术革命，超微粉碎技术是促进中药传统产业改造的有效途径[19]。

黄芪为中医常用中药之一，临床应用量巨大。对各种肝损伤具有保护作用，具有提高机体抗疲劳、增强机体耐力的作用[20-22]。本研究利用低温粉碎技术将黄芪饮片制成黄芪超微粉，比较黄芪饮片和黄芪超微粉对CCl4所致的肝损伤、耐游泳疲劳以及主要成分黄芪甲苷的影响，试图阐释黄芪超微粉的药效和主要成分的变化。

显微表征和粒度表征分析表明黄芪超微粉粒径分布范围为0.45～709 μm，小于80 μm的颗粒累积大于80%，提示我们制备的黄芪微粉大部分属于超微粉的粒径范围。CCl4导致肝损伤是经典模型之一，能准确反应肝细胞功能、代谢及形态学变化[23]。本研究采用1% CCl4橄榄油腹腔注射小鼠18 h后成功复制了肝损伤模型。病理结果显示肝损伤模型小鼠肝脏出现严重坏死现象，肝脏功能指标AST和ALT均显著增高，与其他学者制备的肝损伤模型指标变化趋势一致[23-24]。而10 g·kg-1黄芪饮片和10 g·g-1，2 g·kg-1个0.4 g·kg-1黄芪超微粉组均可以显著逆转1%CCl4所致的肝脏坏死和肝功能指标的升高。我们采用游泳实验制备了疲劳模型，游泳实验可以很好的模拟机体的慢性疲劳状态[25]。本研究显示模型组小鼠的血中乳酸含量明显提高，与其它研究者报道一致[26-27]，提示模型建立成功。本研究显示10 g·kg-1黄芪饮片和10 g·kg-1，2 g·kg-1个0.4 g·kg-1黄芪超微粉组可以延长小鼠的游泳时间，可以明显降低小鼠血中的乳酸含量，与朱凯峰[28]研究结果基本一致。黄芪甲苷是黄芪的主要指标成分之一[9]，多个学者研究显示黄芪超微粉碎后可以明显提高包括黄芪甲苷多个成分在内的溶出量[29-31]。本研究采用高效液相法检测成分分析显示，黄芪超微粉中黄芪甲苷含量明显高于黄芪饮片，提示黄芪饮片破壁后有利于成分的溶出析出，这也可能是低剂量黄芪超微粉即显示药效的原因之一。本研究中值得关注的是0.4 g·kg-1黄芪超微粉组的肝保护作用和耐疲劳作用与黄芪饮片组相当，但黄芪超微粉各剂量组之间没有显著差异，提示小剂量的黄芪超微粉即可与低于25倍的黄芪饮片作用相当，但中高剂量的黄芪超微粉并没有提高药效，是否与体内吸收的量有关，还需要进一步研究。