核仁磷酸蛋白在原发性肝癌中的表达水平及临床意义

周 君，侯佳影，王丽萍，于文清，周 雪，刘清华

(1.石河子大学医学院第一附属医院肿瘤内科，新疆 石河子 832008；2.新疆医科大学第一附属医院昌吉分院，新疆 昌吉 831100；3.重庆市綦江区人民医院感染科，重庆 401420；4.德阳市人民医院肿瘤科，四川 德阳 618000)

原发性肝癌(PHC)在我国乃至全世界都具有极高发病率和致死率，发病率达4.7%，在世界范围内的恶性肿瘤中居于第六，在癌症致死率方面，排名第三，仅在肺癌与结直肠癌之下[1]。在世界新增男性肝癌人员中，我国占据了1/2左右，同时肝癌位于男性癌症死亡谱第二位[2]。因此肝癌疾病负担长期居高不下，在我国西部和农村地区尤其突出[3]。肝癌常隐匿发病，多数病例在进展为中晚期才被发现，显著增大了早期诊断与干预治疗肝癌的难度。肝癌诊断主要通过影像学、病理学以及基因测序、血清肿瘤标志物检测等手段，因早期病灶较小，影像学敏感度较差，同时病理学检测的创伤性，常不作为疾病诊断的首选。因此，对于无法接受病理学检查的人员，血清肿瘤标志物测定可起到关键性的补充作用，经由此项检查，或与其他类型诊断结果联合判断，实现早期发现肝脏肿瘤病灶。核仁磷酸蛋白(NPM)属于核磷蛋白家族，NPM1是NPM家族中研究最为广泛的成员，与其同属于一个家族的蛋白还包括NPM2和NPM3。细胞中NPM的生物学功能较为复杂，涉及参与核糖体的合成，与中心体复制紧密相关，通过调控蛋白周期发挥分子伴侣功能，同时利用对目标基因的转录调节影响细胞增殖和凋亡[4]。研究发现它在增殖细胞中比在静止细胞中表达水平显著提高[5]。目前国内外多篇文献报道NPM在恶性血液系统疾病、肺腺癌、宫颈鳞癌、膀胱癌及口腔鳞状细胞癌[6-8]等多种肿瘤性疾病中高表达，且NPM表达上调大多正向相关于肿瘤的形成、迁移与侵袭。另有文献提示NPM在部分乳腺癌[9]及胃癌组织中[10]表达低于相关癌旁及正常组织，此结果表明，在胃癌(GC)、乳腺癌(BC)内NPM对肿瘤可能起着抑制效应。2015年Ahuja R等发现，在慢性乙型病毒性肝炎(乙肝，CHB)中NPM可介导HBx(乙肝病毒x蛋白)发挥致癌效应，NPM升高常与预后不良存在关联[11]。杨琼等认为，NPM会提高肝纤维化速度，通过使NPM沉默表达和对其进行敲除途径，能够下调相关肝纤维化标志基因，如基质金属蛋白酶9(MMP9)、Collagen Ⅰ与ACTA2等[12]。本研究通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测NPM在健康体检者、CHB、肝炎后肝硬化(LC)及乙肝相关性原发性肝癌(PHC)患者血液和尿液中的表达水平，以期对诊断原发性肝癌提供新思路。

1 资料与方法

1.1一般资料：选取2020年10月～2021年5月本院相关科室就诊的体检健康者(HE)、CHB、肝炎后LC及乙肝相关性PHC患者295例。男156例(53%)，女139例(47%)，年龄(52.82±12.49)岁。67例HE为对照组，65例CHB患者、76例LC患者、87例乙肝相关性PHC患者为试验组。在年龄上，比较慢性乙肝组、LC组未见明显区别，其余组别皆显示明显区别(P<0.05)。见表1。试验获得本院医学伦理委员会准可，受试者在试验前均被详细告知相关注意事项并由本人及家属签署知情同意书。

表1 研究对象基本信息

1.2纳入标准及排除标准

1.2.1纳入标准：①CHB患者、LC患者需与我国《慢性乙型肝炎防治指南》(2015版)[13]所示诊断条件相符；②乙肝相关性PHC病例符合我国2017年《原发性肝癌诊疗规范》[14]诊断要求；③在Child-pugh分级中，肝功能属于A级、B级；④各组病例自愿参加本临床研究，在本院存有完整临床资料。

1.2.2排除标准：①其他类型病毒性肝炎(不含乙肝)及其所致的肝硬化、肝癌；②合并其他类型恶性肿瘤；③继发性肝癌；④在Child-pugh分级中，肝功能属于C级与/或大量腹水的存在；⑤合并泌尿系炎性疾病或其他慢性基础疾病；⑥参与度差，漏脱风险高的患者。

1.3方法：所有入组对象于标本采取前1天22∶00后禁食，次日晨抽取外周静脉血5 ml置于EDTA采血管中(紫头管)，同时收集清晨中段尿标本5 ml置于尿管，静置后使用离心机(鑫奥GENIUS 4K)以4 000 r/min离心10 min，二者上清液均分装于无酶EP管后冰箱冻存备用。采购泉州市九邦生物科技有限公司的NPM通过ELISA检测试剂盒检测血、尿样本，具体操作严格遵照实验说明书进行。采用美国Bio-Tek(博腾)ELx800多功能酶标仪进行吸光度检测。利用实验所获OD值建立坐标系绘制标准曲线以推算血清、尿标本NPM含量。

2 结果

2.1血液常规、生化功能、凝血功能分析表：收集HE、CHB、LC、PHC病例的相关临床资料，统计分析提示各组红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板(PLT)、清蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)及凝血酶原活动度(PTA)、凝血酶原时间(PT)、INR比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。四组肌酐值(Cr)比较，差异无统计学意义(皆P>0.05)。见表2。

表2 血常规、生化、血凝指标表达情况[P50(P25，P75)]

2.2血清、尿液NPM表达水平：血清NPM在HE中表达明显低于CHB组、LC组及PHC组，差异有统计学意义(P<0.001)；LC组、PHC组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；尿液NPM在试验组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3，图1。

表3 血液、尿液NPM在原发性肝癌不同病理阶段表达水平[P50(P25，P75)，ng/ml]

注：与HE组比较，①P<0.001

2.3血清NPM对PHC的诊断效能：血清NPM对乙肝、肝硬化、肝癌均有一定诊断价值，当约登指数最大为0.34时，可检出在诊断肝癌上，实现50.0%的敏感度，与84.0%的特异度，AUC=0.682。见表4，图2。

表4 血清NPM诊断原发性肝癌的效能(ng/ml)

图2 各指标单一与结合诊断PHC的ROC曲线

2.4血清甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖类抗原199(CA199)、NPM对PHC的诊断价值：统计分析四组对象的一般临床资料(血清AFP、CEA、CA199)，将其与血清NPM相结合进行肝癌联合诊断，描绘ROC曲线下面积。由表可知：与血清CEA、AFP、CA199联合测定能够促进肝癌诊断的灵敏度提升。见表5，图2。

表5 血清NPM与AFP、CEA、CA199对原发性肝癌的诊断价值比较

2.5NPM在AFP阴性PHC中的诊断价值：临床实践中，观察到一些PHC患者血清AFP表达低于预期诊断水平，从而降低的肝癌患者检出率。本研究所收集的肝癌组中部分患者表现AFP阴性，统计处理这些患者的血清NPM表达量，并绘制ROC曲线，在确定约登指数最大为0.403时，AUC等于0.713 9，另特异度、灵敏度各是67.6%、72.7%。结果表明NPM对血清AFP阴性PHC患者也有一定的诊断价值。见图3。

图3 血清NPM诊断AFP阴性原发性肝癌的ROC曲线

3 讨论

NPM的快速穿梭功能使其参与到许多细胞生物学过程中[15]。此外，NPM染色体变异可影响细胞生长发育[4]。目前多篇文献报道NPM与恶性肿瘤发生发展存在密切关系，可用于肿瘤的早期诊断。现有文献里关于血液中NPM的报道以血液系统疾病居多，暂未检索到尿液中NPM研究的报道。

本试验通过ELISA法检查试验组与对照组血清、尿液NPM表达水平，探究其在原发性肝癌中的表达规律及临床意义。本研究血清NPM检测结果与任鹏飞等提出的血清NPM单项对肝癌的诊断价值AUC可达0.713 9的结论相符[16]。

NPM在各组尿液检测中表达无显著差异。查阅国内外相关文献目前尚无关于NPM在尿液中的报道。周金煦等检测血液、胆汁及尿液中AFP表达水平时发现，尿检中APF含量常与肝癌瘤体大小、肿瘤分期以及血液AFP表达呈正相关，且通常仅占血液的0.3%[17]。丁俊峰发现尿液中核基质蛋白22(NMP-22)含量在膀胱癌术后降低约2.3倍[18]。考虑肿瘤动态生长过程中细胞核内物质活跃，引起表达增高，在根治或减瘤术后表达骤降。由于本次研究所选取试验病例偏少，未对原发性肝癌患者进行具体临床分期及治疗方式筛查，不除外为统计误差所致，后续可经由提高样本量途径实施再次验证，以探究原发性肝癌中尿液NPM的表达情况。

NPM在乙肝、肝硬化、肝癌患者血液中表达出现呈递增状态，云径平等在观察鼠肝切除术中发现NPM在肝脏再生过程中呈抛物线式表达，肝脏作为重要代谢器官其再生及修复能力极强[19]。乙肝病毒不断复制推进病情进展过程中，肝细胞长期处于坏死与修复相互交替的状态，NPM高表达可能在乙型病毒性肝炎病程发展中存在提示意义，可作为肝再生过程中评价肝细胞增生程度的标记物。

由于肝炎后肝硬化是慢性乙型病毒性肝炎向原发性肝癌进展转化的必由病理阶段，血清NPM在诊断PHC方面可能起着关键性作用。Liu M团队发现NPM1抗体多出现于肝癌早期，检测其阳性率可达22.4%[20]。王科妍等对PHC进行分期研究时发现，NPM等指标在肝硬化组中略高于TNM-Ⅰ期肝癌组，TNM-Ⅰ期肝癌组高于其他分期肝癌组，且均高于健康对照组[21]。既往通过收集研究PHC患者确诊前12个月、9个月、6个月、3个月的血清发现越接近肝癌诊断时间点NPM阳性率越高[22]。杨琼提出NPM、ACTA2和p-AKT/p-mTOR蛋白质在由TGF-β、LX-2细胞激活的肝星状细胞中高表达，对NPM基因行沉默表达或敲除处理，可使MMP9、ACTA2与Collagen Ⅰ这三类肝纤维化标志基因表达下调，NPM此调控功能的达成可能离不开Akt途径[12]。李祺福等等在对SMMC-7721的研究中发现NPM与c-Fos、c-Myc、mtP53、Rb等基因共同定位在细胞核基质上及细胞中，研究提示NPM可能通过改变其分布与表达、与原癌基因和抑癌基因的互相作用、蛋白质修饰来调控肿瘤细胞诱导分化[23]。

临床方面，大多将AFP当做肝癌标志物来应用。Wang T在研究[24]中发现NPM自身抗体在甲胎蛋白阴性肝癌中阳性表达率为21.4%。任鹏飞还发现自身抗体联合诊断AFP阴性的肝癌的阳性率为89.7%[16]。说明血清NPM对进一步筛选AFP阴性肝癌病例仍有潜在价值，可为AFP阴性病例诊断提供新思路。曾有研究[16]提示AFP联合NPM在内的自身抗体检测肝癌的阳性检出率为96.6%，表明各生物标志物联合诊断可不同程度上提高原发性肝癌检出率[25]。本试验统计分析NPM与AFP、CEA、CA199四项联合诊断原发性肝癌敏感度提高至63.0%，AUC=0.740，高于各指标单独诊断价值。此时特异度稍降为78.1%，结合早期肝癌症状体征难以察觉、检出难度大等特点，此时对高敏感性指标的要求更为迫切，可见，联合诊断不仅可使诊断敏感度大幅提升，还不会明显影响特异度，有助于早期肝癌的诊治。

综上所述，PHC血液中NPM过表达，在早期肝癌及肝硬化中尤甚，提示NPM与肿瘤发生发展存在良好相关性。同时对于APF阴性PHC病例而言NPM仍存在不错的检出率。NPM与其他常见肿瘤标志物联合诊断PHC效率可得到显著提升，可见其具备成为肝癌肿瘤标志物的潜力。目前尚不知晓NPM通过何种生物机制在原发性肝癌发生转化过程中发挥作用，研究其作用机制可能为肝癌化学治疗、靶向治疗以及耐药性等方面提供全新解题思路，故研究其病理机制可作为本试验的后续主要方向。