黄秋葵中螺螨酯残留检测及膳食摄入评估

吴绪金，许海康，宋 键，马婧玮，安 莉，李 萌，汪 红

（1.河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 郑州 450002； 2.商丘市实验中学 河南商丘 476000）

黄秋葵（L）在我国河北、山东、江苏、浙江、湖南、湖北、云南和广东等省份广泛种植。螺螨酯英文通用名为spirodiclofen，分子式是CHClO，化学名称为3-（2，4-二氯苯基）-2-氧-1-氧螺[4.5]癸-3-烯-4-基-2，2-二甲基丁酸酯。螺螨酯是一种高效低毒的新型季酮酸杀螨剂，其作用机制是通过抑制螨虫体内脂肪合成，阻止能量代谢活动杀死螨虫。螺螨酯主要用来防治的作物有草莓、柑橘、核果、梨果、葡萄、坚果等，主要防治对象是螨虫，包括锈螨属、叶螨属、全爪螨属、刺绣螨属、短须螨属等螨虫。

国内外文献关于螺螨酯的研究主要包括农药残留风险监测、加工过程中农药残留的变化、降解菌株的筛选、残留消解试验及检测方法等。目前已相继报道了螺螨酯在柚子和柚子茶中的风险监测，李子加工成话梅过程中农药残留的变化。贾海飞等发现肠杆菌属菌株QD26-6 48 h 和120 h 对螺螨酯降解率分别为45.82%和71.72%。螺螨酯在柑橘中的半衰期为4.70 d、5.18～8.49 d、8.0～11.8 d，在苹果中的半衰期为11～19 d，在土壤中半衰期为5.19～7.85 d 和1.4～4.1 d。目前，关于螺螨酯残留检测方法报道较少，已报道的检测方法主要有烟草和土壤中螺螨酯残留量的高效液相色谱二极管阵列检测器检测法。前处理分别为加速溶剂萃取，硅胶净化；乙腈和水（∶=4∶1）混合振荡提取，0.45 um 有机滤膜过滤。柑橘中螺螨酯经乙腈提取，N-丙基乙二胺固相吸附剂（PSA）净化，0.22 μm 有机滤膜过滤，超高效液相色谱三重四极杆串联质谱检测。柑橘、苹果和土壤中螺螨酯前处理分别为混合提取剂（∶=4∶1）提取，Florisil 小柱净化；乙腈提取，氮吹浓缩定容；乙腈提取，弗罗里硅土净化，气相色谱电子捕获检测器检测。9 种果品中螺螨酯残留量的气相色谱三重四极杆串联质谱检测法，前处理为乙腈涡旋提取，乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）和ODS-C净化。综上所述，国内外关于螺螨酯的报道主要有消解半衰期和残留检测方法，但未见关于螺螨酯在黄秋葵中的残留检测、最终残留试验和膳食摄入评估的报道。本研究建立了螺螨酯在黄秋葵中的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱检测法，对河南、湖南、山东、北京、吉林和广东6 地的黄秋葵样品进行了检测，并对黄秋葵中螺螨酯的膳食摄入量进行评估，为螺螨酯在黄秋葵上的安全合理使用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试品为天津市汉邦植物保护剂有限责任公司提供的24%螺螨酯悬浮剂；供试作物为黄秋葵，河南试验品种为五福，由河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所提供；湖南试验品种为南洋，由湖南文谱检测技术研究有限公司提供；山东试验品种为绿盐，由山东省农业科学院植物保护研究所提供；北京试验品种为清福，由北京天然至诚农业科技有限公司提供；吉林试验品种为绿箭，由吉林农业大学提供；广东试验品种为五福，由广东省农业科学院提供。

试剂：乙腈和甲醇（色谱纯，默克股份两合公司），N-丙基乙二胺固相吸附剂（PSA）和石墨化碳黑吸附剂（GCB）（天津博纳艾杰尔科技有限公司），甲酸（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司），氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），螺螨酯标准物质（纯度为99.0%，德国Dr.Ehrenstorfer）。

仪器：LC-30AD 高效液相色谱仪（日本岛津仪器公司），LCMS-8050 质谱仪（日本岛津仪器公司），Shim-pack GISS 液相色谱柱（日本岛津仪器公司，（2.1 mm×50 mm，1.9µm），SQP 系列电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]，BS 2202 S 电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]，Milli-Q Synthesis 超纯水系统（Millipore 公司），KQ-5200 超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），TARGINVX-Ⅲ多管涡旋振荡器（北京踏锦科技有限公司），L-550 台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），R10 V.V.食品切碎搅拌机（法国Robot Coupe 公司）。

1.2 试验设计

于2018 年7 月12 日至9 月5 日进行田间试验，设置河南省新乡市平原新区王村、广东省湛江市麻章区麻章镇、湖南省长沙市古港镇沔江村、山东省淄博市开发区闫高村、北京市顺义区木林镇荣各庄村、吉林省四平市双辽市那木乡建设村6 个试验地点。施药次数分别为2 次和3 次，施药间隔为7 d，施药剂量以有效成分计算分别为90 g a.i.·hm和135 g a.i.·hm，每个处理3 次重复。最后1 次施药后1、3、5、7 d 完全随机采样，每次在处理小区和对照小区内的黄秋葵植株分别随机采集样品2 kg以上。将采集的田间样品去除果柄后加干冰粉碎，-20 ℃贮藏待测。样品检测在河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所实验室进行，检测时间为2018 年11－12 月。

1.3 检测方法

1.3.1 提取及净化 准确称取10.00 g 粉碎后的黄秋葵样品于100 mL 离心管中，然后加入20 mL 乙腈和2.5 g 氯化钠。将离心管放置于多管涡旋振荡器中涡旋10 min 后，放入离心机中4 000 r·min离心5 min。分别称取0.05 g PSA 和0.02 g GCB 于2 mL 离心管中，从离心后的100 mL 离心管中移取2 mL 上清液至该离心管，涡旋1 min 后放入离心机4 000 r·min离心5 min，0.22 μm 针孔滤膜过滤，LC/MS/MS 检测。

1.3.2 仪器条件 柱温40 ℃；流速0.3 mL·min；流动相为体积比2∶8 的0.1%甲酸水溶液-乙腈；电离方式为ESI；CID气为270kPa；雾化气流量为3.0L·min；加热气流量为10 L·min；接口温度为300 ℃；DL温度为250 ℃；加热块温度为400 ℃；检测方式为多重反应监测（MRM），定性离子对为411.1/71.2/和411.1/313.05/，定量离子对为411.1/71.2/，碰撞电压为16 eV 和11 eV。

1.3.3 标准曲线及添加回收率的获得 将纯度为99.0%螺螨酯标准品用乙腈稀释制成标准溶液，质 量浓度分别为0.005、0.010、0.020、0.050、0.100 mg·L，仪器检测条件见1.3.2。将黄秋葵空白对照样品中加入不同浓度的螺螨酯标准溶液，混合均匀，放置2 h，样品提取净化见1.3.1。

1.4 膳食摄入评估

1.4.1 长期膳食摄入风险评估 依据卫生部2002

年发布的《中国不同人群消费膳食分组食谱》中的膳食结构数据和已制定的螺螨酯最大残留限量（maximum residue limit，MRL），结合本试验螺螨酯残留化学评估推荐的规范残留试验中值，计算螺螨酯国家估算每日摄入量（national estimated daily intake，NEDI），计算公式如下。

式中：NEDI 指国家估算每日摄入量，单位mg·kgbw；STMR为第类初级食用农产品的规范试验残留中值，单位mg·kg；STMR-P为第类加工食用农产品的规范试验残留中值，单位mg·kg；F为第类食用农产品的消费量，单位kg·d；bw 为人群平均体质量，单位kg；ADI 为每日允许摄入量，单位mg·kgbw；ADI%为国家估算每日摄入量占每日允许摄入量的百分率。

1.4.2 急性膳食摄入风险评估 黄秋葵单个质量低于25 g，国家估算短期摄入量（national estimated short term intake，NESTI）计算采用公式3。

式中：NESTI 指国家估算短期摄入量单位mg·kgbw；LP 为可涵盖97.5%的食用者的每天消耗食品的量，单位kg·d；HR 为可食部分的混合样本中的最高残留量，单位mg·kg；HR-P 为加工农产品的最高残留量，单位mg·kg；bw 同公式1；ARfD 为急性参考剂量，单位mg·kgbw；ARfD%为占急性参考剂量的百分比。

1.5 数据计算

数据计算采用Microsoft Excel 2010，采用IBM SPSS Statistics 23 进行邓肯氏单因素方差分析。

式中：为待测样品中农药残留量，单位μg·kg；为标准溶液浓度，单位μg·mL；为待测样品峰面积；为标准溶液峰面积；为标准溶液进样体积，单位μL；为待测样品定容的体积，单位mL；为待测样品的进样体积，单位μL；为待测样品的质量，单位g。

2 结果与分析

2.1 检测方法

2.1.1 标准曲线 标准曲线=29 716 569.85+9 035.92，=1.00，浓度为横坐标，峰面积为纵坐标。当样品浓度（，后同）>0.2 mg·kg时，对样品进行不同倍数的稀释，以满足标准曲线的线性范围。

2.1.2 添加回收率 黄秋葵中螺螨酯的最低检测浓度为0.01 mg·kg。当螺螨酯在黄秋葵中添加水平为0.01、0.10、2.00 mg·kg时，平均回收率为78.93%～82.41%，相对标准偏差为8.97%～10.94%，结果见表1。

表1 黄秋葵中螺螨酯的添加回收率试验结果 %

2.2 螺螨酯最终残留量

2018 年6 地不同施药剂量、施药间隔和采收间隔期，黄秋葵中螺螨酯的最终残留量检测结果见表2。采收间隔期1 d 和3 d 时，残留量最高的试验地点均为广东，残留量分别为0.58 mg · kg和0.45 mg·kg；采收间隔期为5 d 和7 d 时，残留量最高的试验地点均为吉林，残留量分别为0.11 mg·kg和0.06 mg·kg。

表2 黄秋葵中螺螨酯最终残留量测定结果 mg·kg-1

从表3 可以看出，两个施药剂量，施药2 次和3次时，相同采收间隔期残留量之间没有显著差异。当施药剂量为90 g a.i.·hm、施药2 次时，不同采收间隔期之间残留量没有显著差异；施药3 次时，采收间隔期1 d 的残留量高于7 d，存在极显著差异。当施药剂量为135 g a.i.·hm、施药2 次时，采收间隔期1 d 的残留量高于7 d，存在显著差异；施药3次时，采收间隔期1 d 的残留量高于5 d 和7 d，存在极显著差异。

表3 黄秋葵中螺螨酯的残留量差异分析

2.3 膳食摄入评估

长期膳食摄入风险评估结果见表4，螺螨酯普通人群的国家估算每日摄入量是0.003 1 mg，占日允许摄入量的0.5%。黄秋葵可涵盖97.5%食用者每天消耗食品量（LP）为0.082 3 kg·d，可食部分的混合样本中的最高残留量（highest residue，HR）为0.95 mg·kg，按照急性膳食摄入风险评估公式进行计算，螺螨酯的国家估算短期摄入量（IESTI）为0.001 241 mg·kgbw，查询到急性参考剂量（ARfD）为不需要，不必计算占急性参考剂量的百分比（ARfD%）。

表4 螺螨酯风险评估

3 讨论与结论

农业行业标准《农作物中农药残留试验准则》规定，当添加水平为0.01 mg·kg时，回收率范围为60%～120%，相对标准偏差应≤30%；添加水平为0.10 mg·kg时，回收率范围为70%～120%，相对标准偏差应≤20%；添加水平>1.00 mg·kg时，回收率范围为70%～110%，相对标准偏差应≤10%。笔者试验结果表明，黄秋葵中螺螨酯3 个添加水平分别为0.01、0.10、2.00 mg·kg，添加回收率为78.93%～82.41%，相对标准偏差为8.97%～10.94%，定量限为0.01 mg·kg，检测结果的精密度、重现性、准确度均符合《农作物中农药残留试验准则》的规定。

由最终残留量试验结果可以看出，当施药剂量和施药次数相同，螺螨酯残留量与采收间隔期负相关，原因是随着采收时间的延长，部分螺螨酯已消解，同时黄秋葵的生长对螺螨酯消解有一定的稀释作用，与王思威等报道的采收间隔期越短残留量越大一致。当采收间隔期和施药次数相同时，90 g a.i.·hm和135 g a.i.·hm的2 个处理之间螺螨酯残留量不存在1.5 倍关系，施药剂量加倍最终残留量没有增加相应倍数，说明施药剂量和最终残留量不存在倍数关系。当施药剂量和采收间隔期相同时，螺螨酯残留量在2 次施药和3 次施药2 个处理之间没有差异，说明第一次施药对最终残留量的贡献不大，原因是第一次施药时间较早，距采收时间较长，当样品采收时第一次施用的螺螨酯大部分已经消解，这与付岩等报道的水稻中三唑磷原始沉积量与施药次数呈正相关的结果不一致，原因可能是农药性质不同或作物种类不同。当施药剂量与次数及采收间隔期相同时，河南、湖南、山东、北京、吉林和广东之间的螺螨酯残留量存在一定差异，说明气候条件是影响螺螨酯消解的原因之一。采收间隔期1 d 和3 d 时，广东残留量显著高于其他5 地，主要原因是广东施药时黄秋葵植株较小、叶子少、黄秋葵着药较多，说明施药时的植株生长阶段会影响螺螨酯的最终残留量。与秦曙等报道的相同施药剂量下残留量在不同品种苹果上存在显著性差异，残留量高低与重复间小直径样品所占比例呈正相关的报道相似。笔者仅开展了在黄秋葵中螺螨酯残留量差异的研究，其他农药是否也存在类似差异需进一步研究。

我国和国际食品法典委员会（codex alimentarius commission，CAC）均未规定螺螨酯在黄秋葵中的MRL 值，无法通过MRL 值判定黄秋葵样品是否合格，需对黄秋葵样品中的螺螨酯进行长期膳食摄入风险评估和急性膳食摄入风险评估。ADI%≤100%时，表示急性风险可以接受，ADI%越小，风险越小；当ADI%>100%时，表示有不可接受的急性风险，ADI%越大，风险越大。参考原卫生部2002 年发布的中国不同人群消费膳食分组食谱，我国居民的干豆类及其制品、浅色蔬菜、水果和植物油的每日食物摄入量分别为0.016 0、0.183 7、0.045 7、0.032 7 kg。我国已制定螺螨酯在棉籽（植物油）中MRL 值为0.02 mg·kg，在绿豆（干豆类及其制品）和火龙果（水果）上残留中值均为0.01 mg·kg。我国居民的平均体质量为63 kg，螺螨酯在黄秋葵中 的 残 留 中 值 是 0.01 mg·kg，ADI 值 为0.01 mg·kgbw。普通人群的国家估算每日螺螨酯摄入量是0.003 1 mg，占日允许摄入量的0.5%左右，ADI%≤100%，认为螺螨酯在黄秋葵中的残留对一般人群健康的影响是在一个可接受的风险水平，与吴绪金等报道的螺螨酯在火龙果中的膳食摄入风险评估结果一致。黄秋葵急性参考剂量（ARfD）为不需要，不必计算占急性参考剂量的百分比（ARfD%），说明螺螨酯在黄秋葵上使用后不存在急性膳食风险。

黄秋葵中螺螨酯最终残留量与采收间隔期、气候条件和植株生长阶段相关。以黄秋葵中螺螨酯最终残留量，及其长期膳食摄入风险评估和急性膳食摄入风险评估结果为依据，推荐螺螨酯在防治黄秋葵虫害时，用药量90 g a.i.·hm和135 g a.i.·hm，施药次数为2 次和3 次，安全间隔期为7 d。