水稻OsAKT2的钾吸收功能及其在地上部分K+回流中的潜在作用

黄亚楠，李俊林，苏彦华

（1 中国科学院南京土壤研究所/土壤与农业可持续发展国家重点实验室，江苏南京 210008；2 中国科学院大学，北京 100049；3 山东省蚕业研究所，山东烟台 264002）

K+是植物生长发育所必需的三大矿质营养元素之一，也是植物体中含量最丰富的无机阳离子，可占植物干重的10%。K+在调节酶活性、蛋白质合成、细胞渗透势、细胞内电荷平衡以及提高植物对环境胁迫的适应能力等方面有重要作用[1–2]。土壤溶液中的K+浓度在0.01～20 mmol/L波动，而细胞质中的K+浓度维持在50～100 mmol/L范围内且相对稳定[3]。植物中有大量负责K+吸收和转运的功能部件，包括高亲和的钾转运体(在钾浓度<0.2 mmol/L下起作用)和低亲和的钾离子通道(在钾浓度>1 mmol/L下起作用)，它们决定了植物体内诸多功能和调控特性各异的钾吸收系统[4]。一般钾离子通道吸收的K+约占植物总吸钾量的50%[5]，其中Shaker型K+通道被认为是介导植物钾离子吸收、转运和细胞内动态平衡最为重要的一类钾通道[6]。

土壤溶液的K+经植物根表皮和皮层细胞中的钾离子通道吸收，再通过根中柱鞘和木质部薄壁细胞中的钾离子通道将K+运输到植物地上部。叶片保卫细胞作为K+发挥功能的终端，其中的钾离子通道通过调节K+的吸收和外排来调控气孔开关[4–7]。在植物的生长发育过程中，K+具有很强的移动性，叶片中多余的K+可沿韧皮部向下回流到根系中，衰老叶片组织中的K+也可重新分配到幼嫩及生长发育较旺盛的组织。植物体内的这种钾循环可表征地上部钾营养状况并调节根系对K+的吸收[8]。耐低钾型大麦能够高效地将K+转运至功能叶，从而使新生叶保持正常的光合作用和代谢活动[9]。烟草叶片的钾含量是表征烟叶品质的重要指标，由老叶向新叶的K+回流会导致成熟期烟草叶片中K+的流失，从而影响烟叶品质[10]。叶片中K+的分布及含量都会对植物的生理功能产生一定的影响。作为重要的渗透调节物质，K+参与调控气孔开关过程。保持叶片较高的K+浓度使得保卫细胞可以吸收更多的水分，促进气孔的开放[11]。另外K+会影响光合作用所需要酶类的活性、ATP合成、叶绿素含量等。缺K+通常会导致植物光合作用效率下降，并影响光合作用产物的转运[12–13]。但迄今为止，植物地上部K+回流的结构基础和分子机制还有待进一步深入探索。

钾离子通道AKT2主要在韧皮部表达，兼具K+吸收和外排活性，但吸收活性占主导地位。韧皮部AKT2介导自上而下的K+运输，与植物地上部分K+的回流途径相吻合；而其K+外排活性主要体现在对韧皮部细胞极化状态(由H+内流引起)的平衡方面，进而协助蔗糖/H+共转运体将地上部光合同化产物蔗糖经由韧皮部的向下运输过程[14–16]。拟南芥韧皮部AKT2缺失会降低细胞内钾离子和蔗糖含量以及膜电位对K+的依赖性，导致植株生长减缓、发育延迟[14–16]。AKT2的表达丰度受到光照和光合同化产物的诱导，这也暗示其可能参与韧皮部蔗糖的运输[15]。脱落酸处理会增加AKT2的表达丰度，提示AKT2在植物应对干旱胁迫时有重要作用[14]。在盐胁迫条件下，水稻OsAKT2的缺失会使得植株韧皮部的K+降低，导致自上而下的K+再分配过程受损。此外，OsAKT2还调节K+和蔗糖从老叶到新叶中的转运，并影响籽粒形成和产量[17]。

通过归纳分析本领域最新研究进展及本课题组前期工作，发现水稻OsAKT2主要定位于地上部韧皮部细胞[18]，且主要介导K+的吸收，推测其可能在地上部K+回流和再分配过程中发挥潜在作用。为此，通过蛙卵电生理技术研究了OsAKT2介导K+运输的功能特征，包括其电流本身特性、钾浓度依赖性、离子选择性及对钾通道抑制剂的响应情况。进一步模拟田间生长环境，利用实时荧光定量PCR试验测定OsAKT2基因表达的昼夜节律特征及对外界胁迫条件的响应规律。

1 材料与方法

1.1 质粒构建

将水稻OsAKT2(GenBank: JN989970.1)基因经酶切位点SmaI/NotI构建到pCI载体上，用质粒小提试剂盒(Axygen，AP-MN-P-250)提取质粒，并浓缩至 1 μg/μL 待用。

1.2 蛙卵注射与电生理检测

非洲爪蟾(Xenopuslaevis)冰浴麻醉1 h后，用手术刀在其腹部切开小口取出蛙卵，置于1 mg/mL的胶原酶A中消解1～2 h，挑选出健康饱满的蛙卵放入 ND96 溶液 (96 mmol/L NaCl、1.8 mmol/L CaCl2、2 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2、5 mmol/L HEPES，pH7.4)中培养。通过微量注射仪(Nanol 2000，WPI，Sarasota，FL，USA)，将 59.8 nL 的 pCIOsAKT2质粒cDNA注射到蛙卵中，等量的无菌水注射到蛙卵中作为阴性对照。在相应的处理条件下，用“注射OsAKT2的蛙卵产生的电流”减去“注射H2O的蛙卵产生的电流”得到“OsAKT2产生的净电流”，以扣除各离子处理对蛙卵本身的影响。注射后的蛙卵置于19℃的ND96溶液中培养(含50 mg/L庆大霉素)，每天更换一次培养液，并及时去除坏死细胞。2～3天后用双电极电压钳放大器(Axoclamp 900A, Foster City, CA, USA)检测蛙卵细胞电流。在检测电流时，钳制电压为－40 mV，阶越电压为 10 mV，施加的电压范围从－160 mV 到+50 mV，刺激间隔为 2 s。基本检测浴液含有 1.8 mmol/L CaCl2、1 mmol/L MgCl2、5 mmol/L HEPES-NaOH，pH 调整为7.4，KCl和NaCl浓度根据实验设置进行调整(用于调整溶液中的恒定离子强度)。用pClampfit 10.3(Molecular Devices)初步分析电生理数据。

检测所用处理溶液如下：

OsAKT2的钾吸收特征检测： 0、1、2、5、10、20、50、100 KCl (mmol/L)。

OsAKT2 的离子选择性检测： 100 LiCl、100 NaCl、100 RbCl、100 NH4Cl、100 KCl (mmol/L)。

通道抑制剂对OsAKT2的影响检测： 1 BaCl2、1 CsCl、25 TEACl、50 KCl (mmol/L)。

1.3 水稻生长试验

以粳稻日本晴 (Oryzasativa.ssp.JaponicNipponbare)为供试水稻材料。水稻幼苗在改良的IRRI溶液中生长，光周期为16 h光照/8 h黑暗，温度设定为27℃/25℃ (光照/黑暗)，光强度为 400 μmol/(m2·s)，相对湿度设定为70%。将10天苗龄(从水稻发芽后算起)的水稻幼苗移至不同的处理液中：0 mmol/L K+、1 mmol/L K+、20 mmol/L K+、0 mmol/L NH4+、1 mmol/L NH4+、10 mmol/L NH4+、180 mmol/L sorbitol、15% PEG-6000，分别处理 0、4、8、12、20 和 24 h后收获植株，用于RNA提取。

其中改良的IRRI营养液配方为：0.5 mmol/L(NH4)2SO4、0.3 mmol/L KH2PO4、0.35 mmol/L K2SO4、1 mmol/L CaCl2·2H2O、1 mmol/L MgSO4·7H2O、0.5 mmol/L Na2SiO3、20 μmol/L NaFeEDTA、20 μmol/L H3BO3、0.32 μmol/L CuSO4·5H2O、9 μmol/L MnCl2·4H2O、0.77 μmol/L ZnSO4·7H2O、0.39 μmol/L Na2MoO4·2H2O、pH调至5.8。不同的铵处理浓度采用(NH4)2SO4调节，其他离子成分保持不变；不同的钾处理浓度使用KCl调节，并分别用NaH2PO4和Na2SO4取代KH2PO4和K2SO4，其他离子成分保持不变。

1.4 水稻地上部分OsAKT2基因表达丰度的测定

使用总RNA提取试剂(R401-01，南京诺唯赞生物科技有限公司)对收获后的水稻地上部样品进行总RNA提取。用反转录试剂HiScriptⅢRT-SuperMix for qPCR (+gDNA-wipper，R323-01，南京诺唯赞生物科技有限公司)将1 μg总RNA反转录成cDNA。实时荧光定量PCR酶为ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Q711-02，南京诺唯赞生物科技有限公司)。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。使用荧光定量PCR仪LightCycler 480 (Roche,Switzerland)检测基因表达情况，反应条件为：95℃(30 s)，95℃ (10 s)、60℃ (15 s)、72℃ (15 s)，44 个循环。以水稻的看家基因OsActin作为内标，用2–ΔΔCT方法分析目的基因的相对表达量。

1.5 Shaker钾通道的系统进化树分析与关键位点序列比对

钾通道序列由NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站下载获得，利用DNAMAN对这些钾通道序列进行比对分析，并构建Shaker钾通道系统发育树。

1.6 数据处理与分析

使用SPSS 16.0进行统计分析，采用SigmaPlot 12.5绘图，所示数据为平均值±标准误SE (n>3)。多重比较采用Duncan法，差异显著水平为5%。

2 结果与分析

2.1 OsAKT2的氨基酸序列分析

由图1a可看出，OsAKT2在通道孔区域具有特征性的序列TxxTxGYGD，属于典型的Shaker型钾离子通道。根据电压依赖特征和钾离子跨膜流动方向，Shaker型K+通道又可划分为3类：内向钾离子通道(Kin)，主要包括AKT1和KAT1类钾通道；外向钾离子通道(Kout)，主要包括SKOR和GORK类钾通道；以及弱整流型钾离子通道(Kweak)，主要是AKT2钾通道。与内向、外向钾离子通道不同，弱整流型钾离子通道AKT2在S4跨膜区上的关键氨基酸均为带正电的赖氨酸K (图1b)，这可能对其整流性有重要作用。系统进化树的结果显示，水稻OsAKT2在进化上与单子叶植物玉米的ZMK2的亲缘关系最近，大麦HvAKT2次之，与双子叶植物拟南芥的AtAKT2 (56%)等AKT2家族成员也有较高的相似度(图1c)。综上，水稻钾通道OsAKT2与AKT2的其它家族成员具有较高的同源性，且氨基酸序列在进化上具有保守性。

图1 不同Shaker型K+通道的关键序列比对及系统进化树分析Fig.1 Sequence alignment and phylogenetic tree analysis of Shaker K+ channels

2.2 OsAKT2的钾浓度响应

弱整流型拟南芥AtAKT2通道可以同时介导K+的吸收和外排，且电压依赖性较弱[14,19]。借助双电极电压钳电生理技术，发现水稻OsAKT2主要介导K+的吸收，但是缺少明显的外排活性(图2a)。从电流-电压的关系可看出，当外界钾离子浓度高于5 mmol/L时，OsAKT2的电流开始显著增加，而K+浓度达到100 mmol/L时电流基本接近饱和值(图2b和c)，反映了其对外界K+的吸收具有反馈调节机制。在 50 mmol/L K+且膜电位大于–50 mV 时，记录到明显的内向电流，且随着膜电位的降低，电流变得更大(图2c)。OsAKT2的电流具有浓度依赖性和电压依赖性。尽管OsAKT2在生物信息学和结构分析上属于AKT2通道，但是OsAKT2的电流性质与已报道的拟南芥弱整流型AtAKT2明显不同。

用米氏方程拟合OsAKT2的K+吸收动力学曲线，发现在各个膜电位下，Km值(达到1/2最大吸收速率时的钾浓度)均大于 43 mmol/L (图 2c)，是一个典型的低亲和力钾离子通道(在大于1 mmol/L K+浓度下介导K+吸收) (图2d)。在叶片衰老过程中，老叶中的K+要运输至生长旺盛的叶子、果实及种子中，可能会造成细胞内K+释放，导致老叶中K+瞬时增加达到10 mmol/L[20]，而OsAKT2正是在此浓度范围下发挥最适作用，揭示OsAKT2可能在地上部分K+回流和分配中有重要作用。

图2 OsAKT2的钾吸收特征Fig.2 K+ transport kinetics in OsAKT2 expressing Xenopus oocytes

2.3 OsAKT2的离子选择性

对比与K+半径相近的碱金属阳离子通透性发现，在不同膜电位下，OsAKT2对K+的吸收具有较高的选择性，基本不能通透Li+和Na+，对Rb+有轻微的通透能力(图3)。OsAKT2对NH4+有很大的通透性，约占K+吸收量的22%左右(以OsAKT2对K+的吸收量为标准，100%)，推测OsAKT2可能参与体内NH4+的再分配，在缓解体内NH4+毒害方面有一定作用。

图3 OsAKT2对一价阳离子的吸收电流−电压曲线(a)和一价阳离子吸收电流相对于K+吸收电流的比例(b)Fig.3 I−V curves of monovalent ion uptake by OsAKT2 (a) and the current proportion of monovalent ions relative to that of K+ (b)

2.4 钾离子通道抑制剂对OsAKT2的影响

我们检测了K+通道专性抑制剂Ba2+、Cs+和TEA对OsAKT2通道活性的影响，以验证在蛙卵表达系统中产生的电流是否为专一性的钾吸收电流。结果显示，Ba2+、Cs+对OsAKT2电流的抑制作用具有电压依赖性(图4a)，膜电位越负，抑制效果越显著，在膜电位从–80 mV到–160 mV的范围内，Cs+对OsAKT2电流的抑制率从42%增加到了94%；Ba2+对OsAKT2电流的抑制率虽然从42%增加到了78%(图4b)，但较其他高度专一的K+通道来说抑制率较低，这与图3中OsAKT2对离子的通透性特征相吻合(主要通透K+，但是也可以通透一定量的NH4+)(图4c)。而TEA对OsAKT2电流的抑制作用没有电压依赖性，在膜电位从–80 mV到–160 mV的范围内，TEA的抑制率基本维持在70%～79% (图4d)。总之，OsAKT2通道活性受K+通道抑制剂较高程度的抑制，表明OsAKT2产生的电流为专一性的钾吸收电流(图4)。

图4 OsAKT2在钾通道抑制剂Ba2+、Cs+和TEA处理下的电流−电压曲线(a)和稳态电流(b、c、d)Fig.4 I−V curves (a) and steady currents (b, c, d) of the OsAKT2 by the external application of K+ channel blockers Ba2+, Cs+ and TEA

2.5 不同供铵、供钾及胁迫处理对OsAKT2基因表达丰度的影响

为了进一步揭示OsAKT2的作用条件及分子机制，测定了不同供铵、供钾及干旱胁迫(模拟叶片衰老的过程)条件下OsAKT2的表达特征。模拟昼夜光照变化，发现OsAKT2的基因表达受光照条件影响，在光照条件下其表达丰度较低，而在黑暗中OsAKT2表达水平较高(图5)，具有一定的昼夜节律。在处理20 h时OsAKT2基因的表达丰度达到最高，因此在该处理时间进行各处理的基因丰度比较。缺钾(图5a)和缺铵(图5b)处理均会显著增加OsAKT2的表达量，而OsAKT2主要介导地上部K+的吸收(图2)，推测OsAKT2在水稻氮、钾营养亏缺时可促进地上部分离子的回流以保障植物完整的生长发育进程。此外，相比于正常条件，利用sorbitol(山梨醇)处理模拟渗透胁迫增加了OsAKT2基因的表达丰度，PEG处理无显著效果(图5c)。在不同胁迫处理条件下均未改变OsAKT2的昼夜节律变化，这可能是植株应对胁迫条件的一种策略。

图5 不同处理条件下OsAKT2基因的表达丰度Fig.5 OsAKT2 gene expression level in response to different treatments

3 讨论与结论

植物Shaker型钾通道是一类电压门控的K+离子通道，在K+的吸收、转运以及维持细胞内离子动态平衡等方面发挥重要作用[21]。尽管OsAKT2在结构和基本性质上都与典型的AKT2钾通道相似，如二者在氨基酸序列上高度同源，且表现出较高的钾离子选择性，同属于弱整流型Shaker类钾通道(图1)，但是其也表现出一些特殊电流性质。利用非洲爪蟾卵母细胞作为外源表达系统，发现OsAKT2主要介导K+的吸收，缺少明显的外向活性，且表现出明显的电压依赖性(图2)，这与已知的拟南芥AtAKT2的“双向”电流明显不同[14]。AtAKT2的外向活性(不受电压影响)有其特殊的生理意义：K+的外流能够阻止韧皮部细胞内由于H+内流引起的过度去极化，进而通过蔗糖/H+共转运体驱动蔗糖的运输[22]。而水稻OsAKT2缺少明显的外排活性，意味着其可能缺少蔗糖运输的功能。另外，研究表明OsAKT2主要定位在韧皮部[18]，且负责K+的吸收，那么OsAKT2很可能参与了将植株地上部分多余的K+经由韧皮部运往根系，一方面给韧皮部负载提供所需的营养物质，另一方面也作为地上部钾营养状况的重要信号对根系吸收K+进行反馈调节。植株地上部分的K+回流有利于水稻等粮食作物维持其生长部位的功能，但是对于农业生产中需要保持叶片高钾水平的作物如烟草等较为不利。

OsAKT2对于维持细胞内K+浓度稳定发挥着关键作用。本研究发现OsAKT2对外界K+浓度的变化很敏感，且显示出典型的低亲和力特性(Km为43 mmol/L，远大于高亲和系统介导的0.2～1 mmol/L K+的吸收[23])，与已知的其它Shaker型钾通道一致[24]。植物细胞质中的K+浓度一般维持在50～100 mmol/L范围内[25]，这种最佳的K+浓度有利于细胞质中酶的活化[9]。水稻OsAKT2对K+具有较高的选择性(图3)，且会抑制根系对Na+的吸收[17]，表明OsAKT2可能有助于提高植物的抗盐能力。此外，水稻OsAKT2对NH4+表现出一定的通透性(图3)，且缺铵处理会显著上调OsAKT2的表达水平，说明OsAKT2可能对水稻氮素营养吸收转运具有潜在的贡献。植株内多余的NH4+或可通过OsAKT2再回流到根系并进行氨同化，降低植株体内游离NH4+含量，从而缓解NH4+毒害。这一结果对于将来研究水稻体内NH4+回流及再分配有一定的参考价值。

OsAKT2基因的表达呈现出明显的避光性，与AtAKT2基因受光照诱导的特性相反，说明水稻和拟南芥两种植物具有不同的昼夜节律和光合产物分配机制。拟南芥AtAKT2钾通道参与的蔗糖分配过程具有光依赖性[15]，AKT2的一个重要作用就是激活韧皮部质膜协助光合产物的向下运输，从而有效的装载糖类物质[26]。而水稻OsAKT2基因在光照下表达较弱(图5)，且OsAKT2功能缺失并不影响水稻地上部植株的蔗糖含量[17]，表明OsAKT2可能不参与协助蔗糖的运输，这也与OsAKT2缺少明显的外向活性及其可能对应的蔗糖运输功能这一特征相一致(图2)。黑暗条件下，气孔关闭不再提供蒸腾拉力，植物为了满足正常的生长需求，其体内存在一定的离子循环，此时OsAKT2的表达丰度升高(图5)，显示OsAKT2具有潜在的K+回流作用。这些不同植物之间的特异性节律变化可能是植物表现出的适应性进化，具体生理机制有待进一步探索。本研究中基因表达试验采用的是10天苗龄(2～3叶期)的水稻幼苗，该结果可以在一定程度上反映OsAKT2介导地上部分的K+回流，而老叶到新叶的K+回流可能需在4～5叶期的幼苗中进行验证，在此时期，第一片叶已开始进入衰老阶段，便于新的完全展开叶和老叶之间进行比较。

缺氮、缺钾以及干旱等胁迫环境因素会加速叶片老化，缩短植物生育期。本研究发现在这类胁迫条件下OsAKT2基因的表达水平会显著上调，这可能有助于K+从衰老器官运输到生长旺盛的新器官，反映了植物对外界环境的适应性生存策略。相关研究也发现，过表达大麦HvAKT2和HvHAK1能够通过调节叶片H+内稳态和细胞信号传导来提高大麦的耐旱性[27]。而对于喜钾作物烟草来说，保持叶片充足的K+是其品质保证，沈方科等[28]发现环割或断根处理可以阻断物质在韧皮部的运输，从而减少K+向地下部分回流，提高烟叶钾含量。综上，水稻OsAKT2可能在地上部K+的再分配过程中发挥重要作用，这为通过超表达OsAKT2来提高植物抗逆性提供了可能。