微小RNA-203预测胃癌肝转移及预后的临床价值

姜孝奎，李振想，孟鑫，李韶山

胃癌（gastric cancer，GC）是一种高发病率和高死亡率的恶性肿瘤，被列为癌症相关死亡的第二大诱因，并在全球造成较大的健康负担［1］。尽管在GC的治疗上已经取得了较大的进步，但由于频繁复发和远处转移使GC病人的预后仍令人沮丧，肝脏是晚期胃癌血行转移的常见部位［2-3］。为了克服这些临床问题，显然需要识别早期复发或预后不良的生物标志物［4］。miR-203对胃癌转移和临床预后的评估价值还未有研究，本研究通过细胞实验证实miR-203为外泌型miRNA，检测病人外周血中miR-203的水平，分析不同病理特征间的表达差异及对胃癌肝转移和术后3年死亡的预测价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2015年1月至2017年12月在新乡医学院第三附属医院接受手术治疗的胃癌病人115例，男74例，女41例，年龄（56.7±11.3）岁，范围为32～75岁。纳入标准：①术后经病理学诊断为胃癌；②原发性胃癌；③术前未经过放化疗。排除标准：①有传染性疾病、自身免疫病或其他肿瘤；②术后未完成放化疗；③失访病人。同时收集健康志愿者40例为非胃癌病人组，男23例，女17例，年龄（54.7±12.6）岁，范围为34～70岁。

1.2 临床资料收集及术后随访收集病人的一般临床资料，主要包括：性别、年龄、原发肿瘤（T）分期、淋巴结（N）分期、远处转移（M）分期、原发肿瘤、淋巴结、远处转移（TNM）分期、胃癌肝转移、腹膜转移、肿瘤长径、术后3年存活情况。以门诊和电话相结合的方式进行术后随访，最短随访时间14个月，最长随访时间36个月。

1.3 qRT-PCR检测外周血中miR-203 的表达水平收集病人外周血5 mL，以3 000 r/min的速度离心15 min，留取上清放置-80℃冰箱中待用。TRIzol法提取细胞总RNA，使用miRNA分离试剂盒从血清和培养基样品中提取miRNA，经紫外分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0时视为合格品，将提取的总RNA逆转录为cDNA。逆转录条件：40℃、40 min，30℃、10 min。以cDNA为模板。引物序列：miR-203正 向 引 物 序 列 为5′-CTTGCTACTTCATTCAACCAC-3′、反 向 引 物 序 列 为5′-AGTTTGACGTTAGTCCAA-3′，U6正向引物序列为5′-CTGCGTAATCCTCTGCCTAT-3′、反向引物序列为5′-GTCCCACCGTGTGGTAACCG-3′。PCR反应体系共25 μL：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，双蒸水9.5 μL。反应条件：95℃、20 s，95℃、10 s、60℃、20 s共40个循环，最后70℃、10 s。反应结束，统计每样本循环阈值（CT）。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-203相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.4 统计学方法采用SPSS 21.0软件，计量资料行正态性检测，符合正态分布的资料以表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK-q检验的方法，计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验，单因素和多因素logistic回归分析和Cox回归分析检测影响胃癌肝转移和胃癌术后3年内死亡的危险因素，ROC分析miR-203对胃癌肝转移和胃癌术后3年内死亡的预测价值。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌病人外周血中miR-203 的表达水平与病人临床病例特征的关系胃癌病人外周血中miR-203的表达水平为0.482±0.107，低于非胃癌病人外周血中的水平1.529±0.154（t=8.20，P＜0.001）。胃癌病人的N分期、M分期、TNM分期、肝转移、腹膜转移、术后3年存活情况与miR-203的表达水平有关（P＜0.05），见表1。

表1 胃癌115例外周血中miR-203的表达水平与临床病例特征的关系/

表1 胃癌115例外周血中miR-203的表达水平与临床病例特征的关系/

病例特征年龄＜60岁≥60岁性别男女T分期T1/T2 T3/T4 N分期N0 N1/N2/N3 M分期M0 M1 TNM分期Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ肝转移阴性阳性腹膜转移阴性阳性肿瘤长径＜3 cm≥3 cm术后3年存活情况存活死亡例数60 55 74 41 37 78 67 48 84 31 58 57 90 25 103 12 81 34 93 22 miR-203水平0.504±0.185 0.402±0.143 0.471±0.114 0.435±0.107 0.481±0.154 0.425±0.130 0.691±0.251 0.215±0.117 0.652±0.273 0.254±0.105 0.745±0.214 0.235±0.084 0.705±0.087 0.201±0.207 0.734±0.063 0.172±0.102 0.487±0.124 0.419±0.082 0.594±0.110 0.312±0.104 t值1.95 1.02 0.95 5.30 5.02 6.34 6.32 6.82 1.35 4.32 P值0.098 0.132 0.541＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.105＜0.001

2.2 logistic回归分析影响胃癌肝转移的因素以胃癌是否发生肝转移为自变量，将表1中的因素和miR-203水平代入logistic单因素回归模型中，结果显示T分期、N分期、M分期、TNM分期和miR-203对胃癌肝转移有影响，将对胃癌肝转移有影响的因素代入logistic多因素回归模型中，结果显示N分期、M分期、TNM分期和miR-203为影响胃癌术后肝转移的独立危险因素，见表2。

表2 胃癌115例术后肝转移单因素和多因素logistic回归分析

2.3 Cox回归分析影响胃癌术后3年死亡的因素以胃癌术后3年内是否死亡为自变量，将表1中的因素和miR-203水平代入Cox单因素回归模型中，结果显示N分期、M分期、TNM分期、肝转移、腹膜转移和miR-203对胃癌术后3年内死亡有影响，将对胃癌术后3年内死亡有影响的因素代入Cox多因素回归模型中，结果显示N分期、M分期、TNM分期、肝转移、腹膜转移和miR-203为影响胃癌术后3年内死亡的独立危险因素，见表3。

表3 胃癌115例术后3年死亡单因素和多因素Cox回归分析

2.4 外周血中miR-203 预测胃癌肝转移、胃癌术后预后不良的临床价值外周血中miR-203预测胃癌术后肝转移的曲线下面积（95%CI）为0.91（0.86，0.92），特异度为81.4%，灵敏度为80.3%。预测胃癌术后3年内病人死亡的曲线下面积（95%CI）为0.85（0.81，0.89），特异度为72.4%，灵敏度为89.3%。

3 讨论

胃癌是一种致命的恶性肿瘤，临床治疗面临巨大挑战［5-6］。尽管人们对遗传和表观遗传学的癌症事件的了解越来越多，但缺乏早期评估GC转移和预后的非侵入性方法或生物标记物。非编码RNA特别是miRNA进入“癌症领域”已有10多年的历史，miRNA是内源性的小非编码RNA分子，长度为19-22个核苷酸［7］。超过50%的人类miRNA位于脆弱位点，这些位点与癌症的发生和发展有关［8-9］。多项研究显示，胃癌组织中多种miRNA表达失调，更重要的是有些可以在体循环中被检测到。循环系统中miRNA水平的改变可能与GC病人的生理和病理改变直接相关［10-12］。

MiR-203是公认的抑癌基因，也是启动子甲基化过度的靶标，已被证实可以抑制多种肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和肿瘤血管生成［13-15］。尽管miR-203在GC中已有报道，对miR-203的上皮间质转化和侵袭有影响，但未有研究探讨其作为血清生物标志物的可行性［16］。本研究外周血中miR-203表达水平与N分期、M分期、TNM分期、肝转移、腹膜转移、术后3年存活情况有关，此结果与以往的研究结果有相似之处［17-18］。本研究显示在肝转移、淋巴结转移、腹膜转移和远处转移的病人血清miR-203水平均较低，说明miR-203水平降低有利于转移。MiR-203发挥肿瘤抑制作用［19-20］，可能在GC细胞中被下调，因此GC细胞不能在细胞外环境中产生足量的miR-203，导致其在外周血中的水平降低。以上结果表明，发生肝转移和胃癌术后3年内死亡的病人外周血中可检测到低水平的miR-203，临床对外周血中miR-203监测，对预测GC转移和术后的存活可能具有一定的临床价值。同时回归分析显示，miR-203为胃癌肝转移和胃癌术后3年内死亡的独立危险因素，miR-203对胃癌肝转移和胃癌术后3年内死亡具有一定的预测价值。

综上所述，miR-203在胃癌外周血中的表达水平降低对胃癌肝转移和胃癌术后3年内死亡具有一定的预测价值。