欧月红宝石冰组织培养快繁技术研究

李 芬，刘木清，祝剑峰

（湖北生态工程职业技术学院，武汉 430200）

月季（Rosa chinensisJacq.）原产于中国，是中国传统的十大名花之一［1］，素有花中皇后之美称［2］。17世纪月季被引种传入欧洲，在欧洲经过了几百年的繁育，产生了与传统月季不一样的特征［3］。欧月泛指2000年以后由欧美、日本等地引进的月季新品种。相较于传统月季，欧月观赏性状更为突出：花色丰富、花瓣数量多、花型多样独特、香味多样而强烈、株型多样等［4］。欧月应用广泛，可盆栽、制作切花，也可用作花境和绿篱，深受人们的喜爱，无论从商业还是文化的角度，都是极具潜力的花卉品种［3，4］，在中国的河北、浙江、重庆等地区大量引进种植。

中国月季育苗技术较为落后，生产上仍以传统的扦插和嫁接方式为主，限制了优良品种育苗的速度，难以满足市场的需求［1，5］。根据文献报道，叶贻勋等［6］、于非等［7］先后成功建立了月季组织培养技术体系，欧月品种红宝石冰属微型丰花月季，扦插不易生根，嫁接繁殖系数太低，难以进行大规模育苗，因此采用组织培养工厂化育苗是最有效的方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料

欧月品种红宝石冰来自湖北生态工程职业技术学院大冶试验林场苗圃。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体取材 在4—5月，选择连续晴朗天气，生长健壮的红宝石冰植株，取当年生半木质化的枝条中部作为外植体［8］。将枝条去刺、剥去叶片，用手术刀将每个带芽茎段切割成长为3 cm左右的外植体，切割时注意芽上部留0.5 cm，下部留2.5 cm。

1.2.2 外植体灭菌 将茎段外植体置于烧杯中，盖上纱布，自来水流水冲洗30 min，吸干表面水分。先用75%的乙醇灭菌30 s［9］，期间不断摇动瓶身使乙醇与外植体充分接触，然后用无菌水冲洗1次，再分别使用0.1% HgCl2和2%NaClO灭菌，最后用无菌水冲洗4～5次待用。其中，0.1% HgCl2灭菌时间设5个处理，分别为4、6、8、10、12 min；2%NaClO灭菌时间设5个处理，分别为7、10、12、15、18 min。灭菌期间每30 s振摇瓶身数次。

1.2.3 初代培养 每个灭菌处理接种30瓶（每配方接种5瓶），每瓶接种2个茎段。7 d后统计污染率，15 d后统计成活率，通过比较不同处理的灭菌效率以确定最佳的灭菌方案。计算公式如下。

采用以上最佳灭菌处理，每个培养基配方接种30瓶，每瓶培养基接种2个茎段，30 d后计算萌发率，通过比较不同配方的萌发率以确定最佳的培养基配方。

1.2.4 继代增殖培养 腋芽萌发至1～2 cm时即可转入继代增殖培养。将腋芽从茎段上切取下来，切割成单芽，注意芽的基部保留一部分茎段组织，有利于形成丛芽。每配方接种30瓶，每瓶接种3个单芽，40 d后计算增殖系数。公式如下。

1.2.5 生根培养 待试管苗高度达3 cm左右即可进行生根培养。将丛芽沿纵向切割成单苗，接种到生根培养基中，每配方接种30瓶，每瓶培养基接种3株，30 d后计算每个配方的生根率。公式如下。

1.2.6 炼苗移栽 待试管苗长出3～4条主根，苗高达4 cm时，即可进行炼苗移栽。移栽前2 d，打开瓶口加入少许水进行炼苗，让试管苗适应外界的环境。移栽时要洗去根部多余的培养基，防止烂根。移栽后7 d内需进行精细管理，10 d后进行常规水肥管理。栽培基质分别为D1：河沙、D2：河沙+草炭（1∶1）、D3：珍珠岩+草炭+蛭石（1∶1∶1），以上基质比例均为体积比，各基质均需灭菌。每种基质移栽90株，30 d后计算移栽成活率。

1.2.7 培养基及培养条件 以MS为基本培养基［10］，初代培养、继代增殖培养阶段细胞分裂素选用6-BA，生长素选用NAA，采用双因子试验设计，各选择6个配方；生根阶段只添加生长素NAA［11］，选择6个配方。琼脂7.5 g/L，pH 5.8，蔗糖用量初代培养和继代增殖培养阶段为30 g/L，生根阶段为10 g/L。培养温度为25℃，湿度60%，光照时间为14 h/d，光照度2 500 lx［2］。

2 结果与分析

2.1 不同灭菌剂、不同灭菌时间对红宝石冰外植体成活率的影响

2%NaClO灭菌效果见表1，0.1%HgCl2灭菌效果见表2。从表1、表2可以看出，在污染率方面，2种灭菌剂表现一致，即随着灭菌时间的延长，污染率明显降低。当使用2%NaClO灭菌时间超过18 min后，外植体成活率明显降低；0.1%HgCl2类似，灭菌时间超过8 min后，虽然污染率有所下降，但外植体成活率也呈明显下降的趋势。这与李坤峰等［12］关于灭菌剂在进行外植体表面灭菌时具有两面性，在杀菌的同时对外植体也会造成一定的伤害的结论一致。使用0.1%HgCl2灭菌最佳的时间为8 min，灭菌效率为75.5%，使用2%NaClO灭菌的最佳时间为18 min，灭菌效率为51.9%。综合比较，初代培养外植体最佳的灭菌方式是先用75%的乙醇灭菌30 s，然后用0.1%HgCl2灭菌8 min。

表1 2%NaClO对红宝石冰外植体灭菌效果

表2 0.1%HgCl2对红宝石冰外植体灭菌效果

2.2 不同培养基配方对红宝石冰初代培养腋芽萌发的影响

不同培养基配方下红宝石冰腋芽萌发情况统计见表3。从表3可以看出，不同培养基配方腋芽萌发率的差异较大，当6-BA浓度为0.5 mg/L时，腋芽萌发率非常低，当6-BA浓度高于1 mg/L时腋芽萌发率明显提高，但当6-BA浓度达到2.5 mg/L和NAA浓度达到0.3 mg/L时，则腋芽萌发率又呈明显下降，虽然6-BA对腋芽的萌发起促进作用，但并不是6-BA浓度越高腋芽萌发率越高，NAA和6-BA二者的比例影响腋芽萌发率。其中配方A4的萌发率明显优于其他配方，达到95.1%，因此初代培养最佳培养基配方为MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA。

表3 不同培养基配方下红宝石冰腋芽萌发情况

2.3 不同培养基配方对红宝石冰继代增殖系数的影响

从表4可以看出，不同培养基配方下增殖系数差别较大，随着6-BA浓度的增加，增殖系数也随之增大，证明6-BA能有效地促进不定芽增殖，当NAA浓度超过0.3 mg/L时，虽然6-BA用量在增加，但是增殖系数却反而降低，因此，NAA仅在一定浓度范围内对增殖率起促进作用。根据观察，当NAA浓度过高时，在芽的基部容易产生愈伤组织，反而不利于不定芽的增殖。B3配方增殖系数较其他配方优势明显，因此继代增殖最佳培养基配方为MS+0.2 mg/L NAA+2.5 mg/L 6-BA。

表4 不同培养基配方下红宝石冰继代增殖情况

2.4 不同培养基配方对红宝石冰试管苗生根的影响

红宝石冰试管苗生根情况见表5。从表5可以看出，随着培养基中NAA含量的增加，生根率也相应提高，但当NAA浓度达到0.3 mg/L时，生根率反而下降，试管苗基部产生了较大的愈伤组织块，由此可见，培养基中低浓度的NAA对欧月试管苗生根能起到很好的促进作用。在相同生长调节剂水平下，采用1/2 MS生根率高于MS，因此降低营养元素有利于生根。C4配方生根率比其他配方有明显优势，因此试管苗生根阶段最佳培养基配方为1/2 MS+0.2 mg/L NAA。

表5 不同培养基配方下红宝石冰试管苗生根情况

2.5 不同栽培基质对红宝石冰移栽成活率的影响

不同栽培基质对红宝石冰移栽情况见表6。表6结果显示，欧月红宝石冰在D3珍珠岩+草炭+蛭石的混合基质移栽成活率最高，在D1河沙中，试管苗容易出现烂根，成活率最低。成活的试管苗在不同基质中的生长速度不同，在D3中生长速度最快，D2草炭+河沙次之，在D1中生长最慢，因此D3珍珠岩+草炭+蛭石（1∶1∶1）混合基质最有利于试管苗的移栽成活。

表6 不同栽培基质下红宝石冰移栽成活情况

3 小结与讨论

以欧月品种红宝石冰为试验材料，取其半木质化的中部茎段作为外植体，研究了2种灭菌剂、不同灭菌时间对外植体污染率和成活率的影响，不同生长调节剂水平对腋芽萌发、继代增殖、试管苗生根的影响，3种不同移栽基质对试管苗移栽成活率的影响，成功建立了组织培养技术体系，并筛选出了最佳的灭菌方法、组培各阶段最佳的培养基配方以及移栽的最佳基质。

结果表明，采用0.1% HgCl2灭菌8 min效果最佳，与袁婉君等［13］研究结果一致，该配方不仅能对外植体表面附着的微生物进行有效杀灭，且对外植体材料损伤较小，少有外植体因灭菌发生褐变死亡。初代培养阶段最佳培养基配方为MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA，腋芽萌发率为95.1%；继代培养阶段最佳培养基配方为MS+0.2 mg/L NAA+2.5 mg/L 6-BA，增殖系数为4.09；生根培养阶段最佳培养基配方为1/2 MS+0.2 mg/L NAA，生根率为85.6%；移栽最佳基质为珍珠岩+草炭+蛭石（1∶1∶1），移栽成活率为91.1%。目前，月季组织培养研究较多，但欧月组织培养育苗研究报道较少，本研究成功建立了欧月品种红宝石冰的组织培养技术体系，为其大规模育苗提供了技术支撑，也为欧月其他品种的组织培养育苗技术的建立提供了参考。

外植体灭菌方面，目前已发表的相关研究大多只选用了一种灭菌剂［14-17］，本研究在欧月外植体灭菌方面选用了2%NaClO、0.1% HgCl22种灭菌剂进行对比试验，扩大了灭菌剂的选择范围。在确定最佳灭菌方案时，以灭菌效率为最终的评判指标，即综合比较污染率和成活率2个因素，更有利于筛选最佳的灭菌方案。

关于细胞分裂素对腋芽萌发的影响，本研究结果与叶贻勋等［18］的研究结果一致，即6-BA在一定浓度范围内能起到促进作用，但当6-BA用量过大时反而不利于腋芽萌发，李坤峰等［12］认为6-BA用量过大还会导致试管苗玻璃化，本研究也发现在增殖阶段当6-BA达到3.0 mg/L时，确实有少数瓶苗出现了不同程度的玻璃化现象。关于腋芽着生的位置对丛生芽增殖的影响，郑萍等［19］认为枝条中间部位的最佳，本研究发现枝条不同部位的腋芽在诱导丛生芽时并无明显差别，可能与外植体取材有关，研究材料为半木质化带芽茎段，陈兰芬［8］也认为最适宜作为微型月季的外植体材料为半木质化带芽茎。关于移栽基质方面，本研究发现珍珠岩+草炭+蛭石（1∶1∶1）最有利于移栽成活，且在该基质中组培苗生长最快，因此混合基质有利于移栽，与刘子平等［14］研究结论一致。

关于培养条件，本研究在各个阶段都采用同样的温度、光照度、光照时间等。腋芽萌发阶段光照度的问题，有研究曾报道月季在萌芽阶段适当给予弱光培养会促进月季腋芽萌发［20］，本研究并未采用先弱光、后正常光照度交替试验，下一步需要做光照对比试验，进一步优化培养条件。关于生长调节剂选择方面，本试验与前人的报道类似，腋芽增殖方式选择6-BA和NAA进行配比［1，21-24］，对KT、IAA等生长调节剂研究较少，下一步需要扩大生长调节剂的选择范围，进一步优化培养基配方。关于移栽成活后欧月组培苗的生长情况，本试验未做研究，需要进一步进行栽培试验，研究试管苗与常规嫁接苗在生长势、观赏性状和抗性方面的差异性。