茯苓HPLC指纹图谱的建立及三萜酸含量测定

徐雨生，袁定阳，刘 玲，辛文锋，余正勇，段美娟

（1.湖南农业大学农学院，长沙 410128；2.湖南杂交水稻研究中心杂交水稻国家重点试验室，长沙 410125；3.文山学院三七医药学院，云南 文山 663000）

茯苓（Poria cocos）是一种真菌类中药，常寄生在山间喜光、喜温的松树根部［1］，味道甘甜，服用后作用于心、肺、肾的经络，具有祛除湿气、治疗脾虚、缓解心绪不宁的作用，主要产于湖北省、安徽省、云南省等地。现代研究表明，茯苓酸具有增强机体抵御病毒的能力、提高肝细胞活性、抗菌等作用［2］；炮制后的茯苓主要用来预防以及治疗头痛、食欲不振、心肌梗死等疾病［3，4］。

随着人们对健康的重视，对有关健康的保健品倍感兴趣，茯苓作为药食同源的中药材，为医药保健品市场带来了巨大的商机。目前，市场上大部分茯苓食品都只进行了简单的加工［5］，且各地方的加工工艺存在差别，导致生产的茯苓食品质量参差不齐。中药指纹图谱法是研究各种中药材中比较常见的一种色谱法，因其检测成分较多、可分离难以分离的物质，且具有分离结果准确、效率高、试剂处理简单、多条件分析等优点成为现代指纹图谱技术中最常用的方法之一［6，7］。美国食品和药物审批中心允许采用指纹图谱控制药材、保健品的质量［8］，世界卫生组织也在评估中药质量方面提出建议，可以根据提供的中药指纹图谱，鉴定这味中药的真伪性［9］。

本研究通过建立茯苓HPLC指纹图谱，对11批不同产地的茯苓样品进行指纹图谱研究，确认茯苓样品指纹图谱中的特征峰三萜酸（茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸），并对其含量进行测定，为鉴别茯苓药材真伪及后期开发利用提供借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

800Y型粉碎机，永康市铂欧五金仪器有限公司；HY-FA型电子天平，安徽华标检测仪器有限公司；AK-RO-C2型超纯水机，济南艾肯环保科技有限公司；AS7240型超声波清洗，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；LC-2030型岛津高效液相色谱仪（配置四元泵、在线脱气机、自动进样器、PDA检测器），杭州科晓化工仪器设备有限公司；LX-1018型电热恒温鼓风干燥箱，东莞市力雄仪器有限公司。

1.2 试药

茯苓酸（批号MUST-18072910）、松苓新酸（批号MUST-19032005）、茯苓新酸A（批号MUST-18112002），成都曼思特生物科技有限公司；甲醇为分析纯（批号20180721），泰安市润宏化工科技有限公司；乙腈为色谱纯（批号20180601），济南世纪通达化工有限公司；甲酸为分析纯（批号20170909），淄博安豪化工有限公司；乙酸为分析纯（批号201712101），黄骅市鹏发化工有限公司；去离子水。11批不同产地的茯苓样品见表1。

表1 11批不同产地茯苓样品

1.3 溶液的制备

1.3.1 混合对照品溶液的制备 精密称取对照品茯苓新酸A 1.82 mg、茯苓酸1.90 mg、松苓新酸2.21 mg，置于2 mL的量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，超声后摇匀，于0.45 μm微孔滤膜过滤，制成每毫升含茯苓新酸A 0.91 mg、茯苓酸0.95 mg、松苓新酸1.10 mg的混合对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液的制备 取自然干燥后的茯苓，粉碎（过7号筛），精密称定5.0 g，置于50 mL锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，称量，超声处理（功率100 W，温度60℃）40 min，放冷，再称量，用甲醇补足减失的量，摇匀后静置，取上清液过滤，微孔滤膜0.45 μm，得供试品溶液。

1.4 色谱条件

使用HydroBondPS-C18色谱柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），以乙腈和0.2%甲酸水溶液为流动相，依次进行梯度洗脱，梯度洗脱程序见表2。柱温30℃，流速1.0 mL/min，进样量20 μL，检测波长［10］203、242 nm。以茯苓酸的保留时间和半高峰宽度计算理论塔板数，所求出的结果不得低于5 100。

表2 梯度洗脱程序

1.5 线性关系考察

取1 mL的混合对照品溶液于进样瓶中。按“1.4”色谱条件，波长203 nm，取2、4、6、8、10、12 μL依次进样，以三萜酸的峰面积为纵坐标，混合对照品的进样量为横坐标，绘制标准曲线，得到茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸的线性回归方程及相关系数。

1.6 稳定性试验

精密吸取1 mL茯苓（云南省普洱市）供试品溶液，按“1.4”色谱条件进样，波长242 nm，分别在配制后的0、2、4、8、12、24 h进行检测。

1.7 精密度试验

精密吸取1 mL茯苓（云南省普洱市）供试品溶液，按“1.4”色谱条件进样，波长242 nm，连续检测6次。

1.8 重复性试验

称取6份茯苓（云南省普洱市）样品，按“1.3.2”方法制备供试品溶液，按“1.4”色谱条件进样，波长242 nm处检测。

1.9 加样回收试验

称取6份茯苓（云南省普洱市）样品，按“1.3.2”方法制备供试品溶液，每份加入0.1 mL混合对照品溶液，配制待测溶液，按“1.4”色谱条件进样，在波长242 nm处检测，通过测定茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸的含量，计算平均加样回收率。

1.10 供试品测定

取11批茯苓供试品溶液各1 mL，按“1.4”色谱条件进样，在波长203 nm处检测，为减小误差，每批样品都称取3份。根据检测获得的数据和回归方程，利用外标两点法分别计算茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸的平均含量。

1.11 指纹图谱的测定与相似度分析

1.1 1.1茯苓指纹图谱测定 按“1.4”色谱条件进样，在波长242 nm处对11批茯苓样品进行检测。

1.1 1.2指纹图谱的相关性分析 将茯苓指纹图谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件（2012.130723版），首先对导入的谱图进行统一裁剪，采用多点校正的方法将各谱图中的谱峰进行自动匹配，然后采用平均数法设置一张图谱作为参照，再利用峰匹配形式标出样品指纹图谱的共有峰，最后计算出指纹谱图的相似度。

2 结果与分析

2.1 色谱条件

分别对混合对照品溶液和供试品溶液进行测定（图1），结果显示，各峰分离较好，达到了预期的效果。

图1 混合对照品溶液（a）和茯苓供试品溶液（b）的HPLC色谱

2.2 线性关系考察

以三萜酸的峰面积为纵坐标，混合对照品的进样量为横坐标，绘制标准曲线，得到茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸的线性回归方程及相关系数（r）见表3。说明2个变量之间具有较好的相关性。

表3 茯苓三萜酸的回归方程、相关系数及线性范围

2.3 稳定性试验

根据数据计算得知，茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸峰面积的RSD分别为0.79%、0.98%、0.63%，相应峰相对保留时间RSD分别为1.71%、2.52%、1.44%。说明24 h内溶液的性质没有产生太大变化，表明该方法具有较好的稳定性。

2.4 精密度试验

茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸相应峰面积RSD分别为1.98%、2.14%、1.45%，相应峰相对保留时间RSD分别为1.52%、2.21%、1.26%。从结果可以得出，三萜酸的各RSD很相近，且RSD没有超过3%，说明仪器在检测过程中具有较好的精密度。

2.5 重复性试验

分别将三萜酸的峰面积代入相关回归方程（表3）计算三萜酸含量，并计算其平均值（去除最大值和最小值）。茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸的平均含量分别为1.87、2.21、1.64 mg/g，峰面积RSD分别为1.62%、1.78%、1.15%，相对保留时间RSD分别为2.51%、2.19%、1.63%，表明该方法重复性较高。

2.6 加样回收试验

茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸的平均加样回收率 分别为99.32%、99.85%、99.01%，RSD分别 为1.36%、0.95%、1.51%，说明该方法的回收率较高。

2.7 供试品测定

不同茯苓样品中茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸的平均含量测定见表4。将检测获得的数据利用回归方程分别计算出茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸的含量，并计算其平均值（去除最大值和最小值）。

表4 不同地区茯苓样品中茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸的平均含量 （单位：mg/g）

2.8 指纹图谱的测定与相似度分析

2.8.1 茯苓指纹图谱测定 茯苓中的共有峰色谱见图2。通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件得知，11个地区的茯苓共有峰是1～11号，分别确认1～11号色谱峰为茯苓的特征峰。结果显示，茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸分离效果比较好，且峰面积大，所以选择茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸为参照峰（S）。

图2 茯苓中的共有峰色谱

2.8.2 指纹图谱的相关性分析 不同地区茯苓HPLC指纹色谱见图3，色谱的相似度评价结果见表5。在11个地区的茯苓中，只有安徽省岳西县和湖北省英山县的相似度小于0.800，其他样品的相似度都大于0.800，差别不大，11个地区的茯苓中都能检出1～11个色谱峰，说明各地区的茯苓成分相关性良好，在本试验色谱条件下建立的茯苓指纹图谱指标稳定。

图3 不同地区茯苓HPLC指纹色谱

3 小结与讨论

3.1 提取方法的选择

超声波提取方法具有效果好、速度快的特点，且超声时间一般较短、温度较低。部分药材高温时化学物质容易分解，会损失较多的有效成分，超声提取能避免有效成分的破坏，因此适用于很多类中药材和各组分的提取。药材溶液通过超声提取后，固体物质溶解快速，有效成分分离明显。超声波提取简单易操作，所以本研究采用超声提取的方法，使茯苓的有效成分能更好地分离出来。

3.2 流动相的选择

通过查阅文献得知主要有4种流动相，其中，甲醇-水溶液条件下分离出的色谱峰效果不好，乙腈-去离子水溶液条件下的峰面积比较小，乙腈-0.2%乙酸水溶液条件下的分离效果不好，乙腈-0.2%甲酸水溶液条件下的分离效果较好［11，12］。为达到最佳的分离效果，本研究选择乙腈-0.2%甲酸水溶液流动相并不断改变洗脱比例，进而得到较好的指纹图谱。

3.3 检测波长的选择

从色谱图来看，以203 nm为检测波长时，基线变化不大，测定混合对照品溶液时3种酸的峰形非常明显；但测供试品溶液时峰数目少，图谱效果不佳。以242 nm为检测波长时，基线波动大，峰数目较多，分离效果、谱图效果较好，但采用242 nm波长测定混合对照品溶液时，茯苓酸峰形不明显。因此，线性关系考察及供试品溶液测定时选用203 nm为检测波长，其余均选择242 nm为检测波长。

3.4 11个地区的茯苓指纹图谱比较分析

对比分析11个地区的茯苓相似度，发现除安徽省岳西县和湖北省英山县外，其余9个地区的茯苓都具有较高的相似度。通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件进行峰匹配，发现11个地区的茯苓中都存在11个共有峰，并且茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸的峰形较为明显，也从侧面反映出它们的含量较高，3个峰的相对保留时间较近，说明在本试验条件下，可以获得较好的茯苓指纹图谱。安徽省岳西县和湖北省英山县相似度相对较低，可能是茯苓的收获时节、生长环境、保存方法等方面的原因，但缺乏相关研究，需要进一步探索。

3.5 三萜酸的含量比较

通过建立指纹图谱和回归方程，鉴定并检测了三萜酸（茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸）含量。三萜酸含量表现为四川省西昌市＞安徽省亳州市＞贵州省凯里市＞云南省楚雄市＞河南省新乡市＞湖南省怀化市＞广西省贺州市＞云南省怒江傈僳族自治州＞云南省普洱市＞安徽省岳西县＞湖北省英山县。研究表明，四川省西昌市和安徽省亳州市这2个地区茯苓中的三萜酸含量比其他地区高，如果只考虑三萜酸含量这个因素，可以认定这2个地区的药材质量优于其他地区。通过检测不同地区的茯苓，三萜酸含量有的相差很小，有的相差很大，但是三萜酸含量依然可以作为评价茯苓药材质量的指标之一，为购买优质的茯苓提供选择产地的试验依据。