HPLC法同时测定五味祛脂颗粒中三种成分

李芳婵，庞晓云，付吉利，陈 清，王苏妃，魏博伟

（1.广西中医药大学，南宁 530200；2.广西壮瑶药工程技术研究中心，南宁 530200；3.广西中医药大学制药厂，南宁 530000）

五味祛脂颗粒是广西中医药大学拟开发的广西壮族自治区（简称广西）特色壮瑶药保健食品，由广西藤茶、决明子、葛根、荷叶、百合等药食同源药材组方，可通调龙路、火路，同时兼以扶正补虚，诸症兼顾，相得益彰，具有清热毒、祛湿毒、利水道的功效，通过调节机体的代谢机能，从而达到多靶点、多环节整体协调降血脂的作用。葛根素、二氢杨梅素及杨梅素分别是葛根、藤茶降脂的重要活性成分，本研究采用高效液相色谱法测定产品中葛根素、二氢杨梅素、杨梅素成分的含量，建立五味祛脂颗粒质量控制方法，为控制产品的质量提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

1260 InfinityⅡ型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），Direct-Q 5UV型超纯水机（广西南宁市博美生物科技有限公司），KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

五味祛脂颗粒，广西中医药大学；杨梅素（PLC≥98.31%）、二氢杨梅素（HPLC≥99.57%），成都曼思特生物科技有限公司；葛根素，上海融禾医药科技有限公司；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯），赛默飞世尔科技有限公司；磷酸，成都金山化学试剂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Shim-pack C1（8250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯 度 洗 脱 ：0～15 min，15%A→26%A；15～25 min，26%→50%；采用转换波长测定，0～9 min，波长为250 nm，9～25 min，波长为285 nm；进样量5 μL，柱温30℃。

1.3.2 对照品溶液的制备 取葛根素、二氢杨梅素、杨梅素对照品适量，加入甲醇制成浓度为0.023 0、0.543 6、0.250 4 mg/mL的葛根素、二氢杨梅素、杨梅素混合对照品溶液。

1.3.3 供试品溶液的制备 取五味祛脂颗粒0.2 g，研细，过80目筛，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，称重，超声提取30 min，补重，过滤，取续滤液过0.22 μm微孔滤膜，得到五味祛脂供试品溶液。

取缺藤茶阴性样品0.2 g，精密称定，同五味祛脂供试品溶液制备方法，制备缺藤茶阴性对照品溶液。

取缺葛根阴性样品0.2 g，精密称定，同五味祛脂供试品溶液制备方法，制备缺葛根阴性对照品溶液。

1.3.4 专属性考察 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各5 μL，按“1.3.1”色谱条件进样，记录峰面积。

1.3.5 标准曲线绘制 分别吸取二氢杨梅素对照品溶液2、4、6、8、10、12 μL，按“1.3.1”色谱条件进样测定，记录峰面积。

1.3.6 稳定性试验 取五味祛脂颗粒0.2 g，精密称定，按“1.3.3”方法制备供试品溶液，按“1.3.1”色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，记录峰面积，计算RSD。

1.3.7 精密度试验 取混合对照品溶液，按“1.3.1”色谱条件进样测定，连续进样6次，记录峰面积，计算RSD。

1.3.8 重复性试验 取五味祛脂颗粒0.2 g（6份），按“1.3.3”方法制备供试品溶液，按“1.3.1”色谱条件操作进样，记录峰面积，计算五味祛脂颗粒中葛根素、二氢杨梅素、杨梅素的含量和RSD。

1.3.9 加样回收试验 称取6份五味祛脂颗粒各0.1 g，置于具塞锥形瓶中，以葛根素、二氢杨梅素、杨梅素浓度分别为0.062 0、0.298 8、0.140 0 mg/mL混合对照品溶液代替甲醇，按“1.3.3”方法制备供试品溶液，按“1.3.1”色谱条件进样，记录峰面积，计算加样回收率，计算RSD。

1.3.10 样品测定 精密称取6批五味祛脂颗粒产品各0.2 g，按“1.3.3”方法制备供试品溶液，按“1.3.1”色谱条件操作，记录峰面积。

2 结果与分析

2.1 专属性考察

五味祛脂颗粒HPLC混合对照品、供试品溶液的HPLC色谱见图1。阴性样品在目标成分色谱峰位置的峰面积与供试品目标成分的峰面积之比＜5%，表明阴性样品对检测无干扰，该方法专属性良好。

图1 五味祛脂颗粒混合对照品溶液、供试品溶液的HPLC色谱

2.2 标准曲线绘制

以质量为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），建立线性回归方程。其线性范围、标准曲线和相关系数详见表1。由表1可知，葛根素、二氢杨梅素、杨梅素分别在0.023 0～0.138 0、1.087 2～6.523 2、0.500 8～3.004 8 μg水平上线性良好。

表1 五味祛脂颗粒3种成分的标准曲线和相关系数

2.3 稳定性试验

经测定，葛根素、二氢杨梅素和杨梅素峰面积的RSD分别为2.297%、0.703%、0.635%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4 精密度试验

经测定，葛根素、二氢杨梅素和杨梅素峰面积的RSD分别为1.350%、0.121%、0.145%，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验

经检验，葛根素含量的RSD为3.811%；二氢杨梅素含量的RSD为3.567%；杨梅素含量的RSD为2.253%，表明该方法重复性良好。

2.6 加样回收试验

加样回收试验结果见表2。葛根素、二氢杨梅素、杨梅素的平均回收率分别为102.7%、101.1%、99.7%，RSD分别为2.56%、2.21%、0.78%，说明该方法回收率符合要求。

表2 加样回收试验结果

2.7 样品测定

样品测定结果见表3。从表3可以看出，6批五味祛脂颗粒中，葛根素、二氢杨梅素、杨梅素的平均含量分别为1.67、76.43、27.81 mg/g。考虑到药材的复杂性，限度按平均值下调20%，暂定五味祛脂颗粒中葛根素、二氢杨梅素、杨梅素含量不得少于1.34、61.14、22.25 mg/g。

表3 6批五味祛脂颗粒测定结果 （单位：mg/g）

3 小结与讨论

3.1 含量测定指标的选择

藤茶含有丰富的多酚和黄酮类物质，其中黄酮类的二氢杨梅素含量最高，是藤茶保健作用的重要物质基础［1-3］。二氢杨梅素能降低动物血脂，改善脂代谢紊乱，增强机体抗氧化能力，减轻高脂肪对肝细胞的损伤作用，其作用机制可能是二氢杨梅素激活SIRT1-AMPK通路，抑制脂质合成，促进脂质分解或与促进WAT棕色化有关［4-8］。杨梅素也是藤茶的活性成分，杨梅素的促脂解作用可能是通过激活PKCMEK/ERK信号通路，增加该通路中p-HSL的表达量来实现的，并可能对cAMP/PKA信号通路中相关因子的活性有一定的抑制作用［9］。葛根主要化学成分有葛根素、葛根素木糖甙、大豆黄酮和大豆黄酮甙等，其中葛根素为其重要的活性化学物，能有效降低大鼠血清中甘油三脂、胆固醇、低密度脂蛋白含量而明显升高HDL含量，与HDL-C/TC相比，具有明显的降脂作用［10，11］。胡彦武等［12］研究发现，葛根素可显著调节AS大鼠血脂水平，显著降低血清炎症因子水平，其作用机制可能与抑制MAPK信号通路激活有关。因此，本研究选择二氢杨梅素、杨梅素、葛根素含量测定作为五味祛脂颗粒含量测定指标，为五味祛脂颗粒研发及质量控制提供研究基础。

3.2 色谱条件选择

波长选择：采用二极管阵列检测对样品进行测定，发现二氢杨梅素和杨梅素最大吸收波长为285 nm，葛根素最大吸收波长为250 nm，故选择0～9 min检测波长为250 nm，9～25 min检测波长为285 nm。柱温选择：考察了柱温25、30、35℃对样品检测的影响，在25℃时，二氢杨梅素的峰型不好；30、35℃时，峰型较好，但根据柱效与柱温间的关系，选择较低的柱温可得到较高的柱效，本试验选择柱温为30℃。流动相选择：考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸等流动相，选择乙腈-水、甲醇-水为流动相时峰型不好，拖尾现象严重，乙腈-0.1%磷酸，乙腈-0.2%磷酸为流动相时分离度良好，峰对称性较好，但高浓度的磷酸对管路和柱子损伤较大，故选择乙腈-0.1%磷酸为流动相。

3.3 小结

本方法稳定性强、重复性好、准确度高，可以作为五味祛脂颗粒葛根素、二氢杨梅素、杨梅素含量测定的方法。通过6批五味祛脂颗粒含量的测定，结果表明，五味祛脂颗粒中葛根素、二氢杨梅素、杨梅素含量不得少于1.34、61.14、22.25 mg/g。