三味山姜属中药黄酮类成分对胃溃疡寒证大鼠的作用机制研究

秦华珍，钟 贵，陈俊其，何瑞坤，戴庆玲，柳俊辉

（广西中医药大学药学院，南宁 530200）

高良姜、大高良姜、红豆蔻均属山姜属（AlpiniaRoxb.）中药，具有温中散寒、温胃止呕等功效［1］，黄酮类成分为其主要活性成分之一，具有抗炎、镇痛、抗溃疡、抗肿瘤、抗氧化等药理活性［2-4］。胃溃疡寒证属于中医学“胃痛”“胃脘痛”范畴，患者常见胃黏膜损伤，产生胃痛、胀气等症状［5］。有研究［6，7］表明，山姜属中药对胃溃疡寒证有药效作用，其中黄酮类成分在体外表现出良好的抗氧化能力。为此，本研究通过制备3味山姜属中药黄酮类成分，以大鼠复制胃溃疡寒证模型，测定胃组织中SOD活力及MDA、bFGF、PDGF含量，以探讨3味山姜属中药黄酮类成分对胃溃疡寒证大鼠胃黏膜修复的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 药材与药品 高良姜、大高良姜、红豆蔻均购自安国市冷背药材有限公司，批号：20181018，产地：广西；干姜提取物购自西安宝益丰生物科技有限公司，批号：20190912；95%乙醇（AR）购自西陇化工股份有限公司，批号：20190316；氢氧化钠（AR）购自上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10492126；盐酸（AR）购自西陇化工股份有限公司，批号：20190507；冰乙酸（AR）购自西陇化工股份有限公司，批号：20190507。

1.1.2 动物SPF级SD雄性大鼠，每只180～220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2016-0002。

1.2 试验方法

1.2.1 药物制备

1）造模药物。冰知母水制备：取知母8 kg，加10倍量的纯水浸泡1 h，煮沸后保持微沸1 h，过滤，再加8倍量水煎40 min，过滤，合并2次滤液，加热浓缩至0.5 g/mL生药浓度，静置冷却，分装，保存于4℃冰箱备用。

冰乙酸溶液制备：取一定量的99.5%冰乙酸，加纯水稀释成15%冰乙酸溶液。

2）受试药物制备。取适量高良姜、大高良姜、红豆蔻中药饮片分别粉碎成粗粉，依次加入40倍量95%、60%乙醇，每次回流提取4 h，过滤，合并所得滤液，减压浓缩，回收乙醇至无醇味。将粗提物加适量的水混匀，煮沸，加入1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至10～11，煮沸1 h，过滤，重复2次，合并滤液，滤液加入1 mol/L盐酸溶液调节pH至1～2，水浴保温30 min，放置24 h，析出沉淀，离心，弃去上清液，沉淀用去离子水抽洗2～3次，40℃真空干燥，得到3味山姜属中药黄酮提取物，备用，用时以0.5%羧甲基纤维素钠溶液配成相应浓度。

3）阳性药物制备。以0.5%羧甲基纤维素钠将干姜姜辣素配制成相应浓度，备用。

1.2.2 药效试验

1）分组与造模。取90只SPF级SD大鼠，随机抽取10只大鼠作为空白组，其余大鼠进行胃溃疡寒证造模，每天早上灌服冰知母水（剂量10.44 g/kg，生药浓度0.5 g/mL，给药量2 mL/100 g，温度4℃），下午灌服15%冰乙酸水溶液1 mL，每天1次，连续4 d［5］。末次造模结束后随机分为空白组，模型组，阳性组，高良姜高、低剂量组，大高良姜高、低剂量组，红豆蔻高、低剂量组，共9组。

2）给药。造模结束后第2天开始给药，空白组和模型组灌服0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，阳性组灌服干姜提取物水溶液，受试药物高、低剂量组分别灌服相应样品，根据前期研究［3］，以黄酮得率为基础（高良姜黄酮得率为124.1g/kg、大高良姜黄酮得率为98.1 g/kg、红豆蔻黄酮得率为118.5 g/kg），给药剂量为临床用量的4倍与16倍，给药体积均为1 mL/100 g，每隔12 h给药1次，共给药4次。

3）大鼠胃组织SOD活力及MDA、bFGF、PDGF含量测定。处死大鼠，沿腹腔剪开，剥离胃，沿胃大弯剪开，用生理盐水洗去胃内食物残渣，剪取胃溃疡病灶及周围组织约1 g，加入冰生理盐水，制备10%组织匀浆，3 000 r/min离心15 min，取上清液，备用，参照试剂盒方法测定大鼠胃组织SOD活力及MDA、bFGF、PDGF含量。

1.2.3 统计学处理 试验数据采用SPSS 24.0进行统计学处理，计量数据以（）表示，组间比较采用两样本均数t检验，多组间样本均数比较采用方差分析；以P＜0.05认为有显著差异。

2 结果与分析

2.1 3味山姜属中药黄酮类成分对胃溃疡寒证大鼠胃组织MDA含量与SOD活力的影响

3味山姜属中药黄酮类成分对胃溃疡寒证大鼠胃组织MDA含量与SOD活力的影响见表1。从表1可以看出，与空白组大鼠比较，模型组大鼠胃组织MDA含量极显著增加（P＜0.01），SOD活力极显著降低（P＜0.01）。与模型组大鼠比较，干姜姜辣素组、高良姜高和低剂量组、大高良姜高剂量组、红豆蔻高剂量组大鼠胃组织MDA含量显著或极显著减少（P＜0.05或P＜0.01）；干姜姜辣素组、高良姜高剂量组、大高良姜高剂量组、红豆蔻高剂量组大鼠胃组织SOD活力显著或极显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。各给药同剂量组间比较，各给药组间MDA含量无统计学差异，红豆蔻高剂量组与大高良姜、高良姜高剂量组间SOD活力差异极显著（P＜0.01）。

表1 3味山姜属中药黄酮类成分对胃溃疡寒证大鼠胃组织MDA含量与SOD活力的影响（，n=10）

表1 3味山姜属中药黄酮类成分对胃溃疡寒证大鼠胃组织MDA含量与SOD活力的影响（，n=10）

注：与空白组比较，“Δ Δ ”表示差异极显著（P＜0.01）；与模型组比较，“*”表示差异显著（P＜0.05），“**”表示差异极显著（P＜0.01）；与高良姜组比较，“▲”表示差异显著（P＜0.05），“▲▲”表示差异极显著（P＜0.01）；与大高良姜组比较，“○”表示差异显著（P＜0.05），“○○”表示差异极显著（P＜0.01）；与红豆蔻组比较，“●”表示差异显著（P＜0.05），“●●”表示差异极显著（P＜0.01）。下同

组别空白对照组模型对照组干姜姜辣素组高良姜高剂量组高良姜低剂量组大高良姜高剂量组大高良姜低剂量组红豆蔻高剂量组红豆蔻低剂量组剂量g/kg--0.045 1.072 0.268 0.848 0.212 1.024 0.256 MDA含量nmol/g 38.28±5.60 67.04±6.63ΔΔ 46.34±5.64**49.64±4.55**●●59.26±3.98*50.80±4.30**●●61.67±3.28 51.15±4.17**▲▲○○62.71±5.44 SOD活力U/mgprot 241.25±8.08 161.21±23.02ΔΔ 232.11±11.15**217.15±10.64**○○●●177.46±4.72 220.24±8.36**▲▲●●170.90±1.77 202.18±12.34**▲▲○○182.08±2.52*

2.2 3味山姜属中药黄酮类成分对胃溃疡寒证大鼠胃组织bFGF、PDGF含量的影响

3味山姜属中药黄酮类成分对胃溃疡寒证大鼠胃组织bFGF、PDGF含量的影响见表2。从表2可以看出，与空白组大鼠比较，模型组大鼠胃组织bFGF、PDGF含量极显著增加（P＜0.01）。与模型组大鼠比较，干姜姜辣素组、高良姜高和低剂量组、大高良姜高剂量组、红豆蔻高剂量组大鼠胃组织bFGF含量极显著增加（P＜0.01）；干姜姜辣素组、高良姜高剂量组、大高良姜高和低剂量组、红豆蔻高和低剂量组大鼠胃组织PDGF含量显著或极显著增加（P＜0.05或P＜0.01）。各给药同剂量组间比较，高良姜高剂量组与红豆蔻高剂量组间bFGF含量有极显著差异（P＜0.01），红豆蔻低剂量组与高良姜低剂量组、大高良姜低剂量组间bFGF含量有极显著差异（P＜0.01）；高良姜高剂量组与大高良姜高剂量组间PDGF含量有显著差异（P＜0.05）。

表2 3味山姜属中药黄酮类成分对胃溃疡寒证大鼠胃组织bFGF、PDGF含量的影响（，n=10）

表2 3味山姜属中药黄酮类成分对胃溃疡寒证大鼠胃组织bFGF、PDGF含量的影响（，n=10）

组别空白对照组模型对照组干姜姜辣素组高良姜高剂量组高良姜低剂量组大高良姜高剂量组大高良姜低剂量组红豆蔻高剂量组红豆蔻低剂量组剂量g/kg--0.045 1.072 0.268 0.848 0.212 1.024 0.256 bFGF pg/g 132.82±16.20 193.79±16.68ΔΔ 269.76±28.97**246.62±19.16**●●219.37±13.55**●●234.62±16.70**208.91±15.58●●218.17±19.80*▲▲180.98±15.58▲▲○○PDGF ng/g 385.79±41.12 514.32±62.50ΔΔ 711.60±70.67**668.27±57.10**○557.79±36.94 602.44±61.19**▲558.12±46.19*607.74±49.43**584.25±48.71*

3 小结与讨论

胃溃疡的产生过程与氧自由基密切相关，氧自由基与膜内不饱和脂肪酸结合形成多种脂质过氧化物（LPO），影响细胞膜流动性与通透性，破坏膜上酶与受体功能，致使大量Ca2+内流，线粒体与溶酶体破坏，细胞死亡，同时，氧自由基还能与含巯基的蛋白结合，使蛋白变性失活，破坏酶活性，或是破坏上皮间质中的透明质酸和胶原纤维网，促使黏膜损伤［8］。氧自由基再与细胞膜内不饱和脂肪酸结合形成LPO的终末代谢产物为丙二醛（MDA），其含量直接反映了机体脂质过氧化速率与强度，也可以间接反映组织氧化损伤的程度［9］。同时有学者提出，MDA也是胃黏膜攻击因子之一，具有细胞毒性，会引起蛋白质、核酸等大分子交合，致使细胞代谢紊乱，失去活性，造成细胞死亡［10］。超氧化物歧化酶（SOD）在生物体内的自我保护系统与免疫系统中具有极为重要的作用，是生物体内氧自由基清除的第一道防线［11］。现代科学研究表明，SOD在胃黏膜的自我保护功能中发挥重要作用，SOD能够清除胃黏膜上的氧自由基，减少氧自由基对胃黏膜的损伤，维持胃黏膜的防御功能。在胃溃疡形成的过程中，会产生一系列炎症反应，同时产生大量的氧自由基，SOD活力下降，胃黏膜对氧自由基清除能力减弱，胃黏膜受到大量氧自由基攻击，形成过氧化损伤，导致溃疡形成［12］。

本试验结果显示，胃溃疡寒证模型大鼠胃组织中MDA含量显著增加，SOD活力显著降低，表明其胃组织抗氧化能力下降，氧自由基对黏膜攻击作用增强，胃组织过氧化损伤加剧。给药治疗后，3味山姜属中药黄酮类成分高剂量组及高良姜黄酮类成分低剂量组大鼠胃组织中MDA含量显著减少，高剂量组大鼠胃组织SOD活力显著增加，表明3味山姜属中药黄酮类成分能降低MDA含量，提高SOD活力，推测其能通过提高胃黏膜抗氧化能力，消除氧自由基，降低胃黏膜组织过氧化损伤的作用，达到保护胃黏膜、促进溃疡面愈合的作用。

生长因子是一类由多种细胞分泌，作用于特定的靶细胞，能够特异、高亲和与细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能的多肽类物质。bFGF是人体内存在的一种多功能细胞生长因子，广泛存在于人体中，主要在损伤组织及细胞周围大量分泌，在创伤面愈合的过程中发挥极其重要的作用，能够特异性识别损伤细胞及组织，推动损伤细胞增殖，促进血管新生，修复损伤组织［13］。PDGF是贮存于血小板α颗粒中的一种碱性蛋白质，具有趋化活性，能够促进创伤面血小板凝聚，起到止血作用，同时能够促进上皮细胞分裂，促进血管再生，刺激前列腺素生成，扩张血管。胃溃疡疮面的形成刺激bFGF及PDGF等生长因子的大量分泌，推动胃黏膜细胞增值，修复受损胃黏膜组织与屏障［14］。

本试验结果显示，胃溃疡寒证模型组大鼠的胃组织bFGF、PDGF含量显著增加，表明其胃黏膜屏障受到破坏，胃黏膜屏障内外离子失衡，胃黏膜细胞受损凋亡，胃组织受到胃酸、胃蛋白酶等攻击因子直接影响，产生组织损伤，刺激机体分泌bFGF及PDGF，修复损伤组织。给药治疗后，3味山姜属中药黄酮类成分高剂量组及大高良姜黄酮类成分低剂量组大鼠胃组织bFGF含量显著增加，高剂量组及大高良姜、红豆蔻黄酮类成分低剂量组大鼠胃组织PDGF含量显著增加，表明3味山姜属中药黄酮类成分能够促进bFGF及PDGF的分泌，推测其通过加快胃黏膜细胞的增殖，加快损伤组织及血管的修复，减少创伤面出血，促进胃黏膜上皮细胞分裂，恢复胃黏膜屏障的保护作用。

试验结果表明，3味山姜属中药黄酮类成分能够通过降低MDA含量，增加SOD活力，提高bFGF、PDGF含量，增强胃黏膜抗氧化能力，降低胃黏膜过氧化损伤，促进损伤部位的上皮细胞增殖，修复损伤组织，从而发挥胃黏膜修复作用。