蜂花粉致敏机制与脱敏技术研究进展

2022-09-21陶宇逍李强强周桂华吴黎明

食品研究与开发 2022年17期

陶宇逍，李强强*，周桂华，吴黎明

（1.中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093；2.广西蜜博士蜂业有限责任公司，广西南宁 532706）

蜂花粉是蜜蜂从显花植物花蕊中采集的花粉，经蜜蜂加入花蜜及其唾液混合加工成的一种不规则的花粉团[1]。蜂花粉含有多糖、蛋白质、必需氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质、核酸、酶类、酚酸类、黄酮类化合物以及微量营养素等200余种营养成分，几乎包含了自然界全部营养素。因此，蜂花粉是一种良好的膳食补充剂，并享有“天然微型营养库”的美称[2]。蜂花粉富含生物活性物质，可有效增强免疫力、防止衰老、美容皮肤，同时对炎症、癌症、心脑血管疾病、糖尿病、前列腺疾病等有辅助治疗作用，是理想的功能性食品。但因蜂花粉的致敏性，蜂花粉产品的安全性和质量控制仍是亟待解决的难题[3]。

蜂花粉的来源是普通花粉，因此蜂花粉和普通花粉一样有可能引起人体的过敏反应[4]。花粉过敏原是目前已知的最重要的一种过敏原，许多植物的花粉都会引起过敏患者一定的过敏反应[5]。在一项研究中，用蜂花粉对147名特应性患者和57位健康个体进行过敏皮试，结果发现，具有致敏性的成分是蜂花粉中的花粉，而不是蜜蜂唾液中的酶[6]。目前对于蜂花粉过敏案例的研究并不像其它花粉那样丰富。本文将国内外关于蜂花粉的致敏案例、过敏原分离鉴定、致敏机制评价，以及改善致敏性的加工控制技术相关研究进展进行综述，以期为蜂花粉的安全生产和开发利用提供相关参考。

1 致敏机理

蜂花粉引起的食物源性过敏反应属于I型过敏反应。I型过敏反应的机制是过敏原刺激呼吸道或消化道的免疫细胞，细胞信号由抗原呈递细胞传递到T细胞，T细胞释放细胞因子促进B细胞产生IgE抗体，IgE与肥大细胞表面的Fc受体结合，此时机体处于致敏状态。当机体再次接触过敏原，过敏原与附着于肥大细胞上的IgE结合，肥大细胞发生脱粒，激发过敏反应[7]。致敏过程如图1所示。

图1 I型过敏反应机理Fig.1 Mechanism of type I allergy

2 蜂花粉变应原的分离鉴定方法

2.1 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法

对植物花粉过敏原的研究，研究者们通常利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离花粉粗提液组分并确定其蛋白质的相对分子量，经离子交换层析法分离纯化几类主要的蛋白质，通过免疫印迹法对比鉴定每种主要蛋白质过敏原的致敏性，从而鉴定出蜂花粉中的主要变应原[8]。

陈小文等[9]通过SDS-PAGE对油菜花粉的蛋白质组分进行分离并测定相对分子质量，之后用免疫印迹法测定变应原成分，并通过离子交换层析对油菜花粉变应原进行分离纯化，结果显示，油菜花粉中有10余条蛋白带，其中分子质量为30、25、15、10 ku的蛋白可与油菜花粉过敏症病人的血清IgE结合，其中15 ku和10 ku的蛋白质为主要变应原。目前研究者使用此方法，已分离、纯化得到了椰子、重阳木、大籽蒿、田菁等多类植物花粉的变应原[10-13]。

2.2 双向电泳法

除SDS-PAGE外，双向电泳法也是分离测定过敏原的常用方法。与SDS-PAGE相比，双向电泳法可以得到独立的蛋白质点，且分子量和等电点更加准确。刘硕等[14]使用双向电泳法对真叶葵花粉提取液的蛋白质组分进行分析，电泳图结果显示约有601个主要蛋白斑点，分子量分布约20 kDa～130 kDa，等电点主要集中在pH4.0～8.0。

2.3 聚合酶链反应法

聚合酶链反应法（polymerase chain reaction，PCR）是一种更加灵敏的检测方法，可检测到编码过敏原蛋白质的痕量DNA和RNA，并且结合分子生物学技术可获得完整的致敏蛋白。Midoro-Horiuti等[15]通过雪松花粉样品中的mRNA获得雪松花粉主要过敏原Jun a 1的cDNA基因序列，并由大肠杆菌表达出过敏原蛋白质，之后通过过敏症患者的IgE进行免疫痕迹分析，从而确定了Jun a 1的致敏性。为获得梯牧草中的主要过敏原Phl p 4的完整蛋白并确定其致敏性，Dewitt等[16]通过PCR方法克隆出Phl p 4的全长cDNA，并由大肠杆菌表达出完整蛋白，再通过离子亲和色谱进行分离纯化，成功获得Phl p 4蛋白，并分析出其与芹菜过敏原蛋白Api g 5具有同源性。Vrtala等[17]利用过敏患者的IgE从Phleum pretense花粉中分离出一种由cDNA编码的过敏原，可与约80%的草花粉过敏患者体内的IgE结合，通过重组蛋白鉴定为来自梯牧草Phl p V的V组过敏原。由此可见，PCR法并非直接鉴定样品中过敏原的完整蛋白序列，而是通过检测编码基因间接地获得致敏蛋白序列。

2.4 色谱-质谱联用法

色谱-质谱联用法具有高灵敏性、高分辨率、高自动化等优点，能直接检测过敏原蛋白的存在、亚型、特异性肽段等，并且在检测复杂样品中的多个过敏原蛋白时具有优越性，同时不涉及免疫手段，不需要特异性抗体的参与，被广泛应用于过敏原蛋白的研究中。Seppälä等[18]使用液相色谱-质谱联用技术，鉴定出了梯牧草中的Phl p 1b、Phl p 1a和Phl p 5b 3种过敏原蛋白的含量。付婉艺[19]依据免疫印迹结果，从黄花蒿花粉蛋白提取物SDS-PAGE胶上取蛋白条带，使用高效液相色谱-离子阱质谱联用仪进行鉴定，成功鉴定出黄花蒿花粉中的新过敏原Art an 7。由于花粉的自然变异，花粉中的蛋白质过敏原存在很多同工型，不同的同工型的氨基酸序列可能仅相差一个或几个氨基酸，色谱-质谱联用技术可同时鉴定出多种同工型。Fenaille等[20]基于蛋白质组学的分析方法，使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术，鉴定出来自不同草种的草花粉第一类过敏原存在5个同工型。因此，将质谱技术与各种分离手段相结合，可用于蛋白质组学高通量分析，从而明确致敏蛋白的各种亚型及特异性肽段等[21]。

3 基于过敏动物模型的蜂花粉致敏性评价与机制研究

由于人体实验的安全性和局限性，建立敏感动物的过敏模型研究过敏原是更为安全高效的方法。研究表明，啮齿动物在免疫调节的许多方面与人类相似，并且某些品系属于高IgE反应型，类似于人类的遗传性过敏症，因此过敏动物模型被广泛应用于食物致敏性评价与机制研究中，常用过敏啮齿动物模型见表1。

表1 常用过敏啮齿动物模型Table 1 Commonly used rodent models of allergy

3.1 基于小鼠模型的蜂花粉致敏性评价与机制研究

小鼠作为最常用的动物模型，具有体积小、繁殖快、成本低等优点，目前近亲交配和转基因小鼠以及多种小鼠免疫分子试剂已经商品化，小鼠模型被广泛用于过敏性疾病和过敏机制的研究[33]。

BALB/c小鼠是近亲交配高IgE应答品系，常被作为食物过敏和花粉过敏的动物模型。Castillo-Courtade等[34]用卵清蛋白（ovalbumin，OVA）作为过敏原，氢氧化铝作为佐剂对BALB/c小鼠进行经口灌胃，用大剂量OVA灌胃激发，制备小鼠消化道过敏模型。结果显示，过敏组小鼠中，血清总IgE、OVA特异性IgE和OVA特异性IgG表达量增高，回肠、结肠及血清中mMCp-1表达量增高，脾细胞、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和白细胞介素-3（interleukin-3，IL-3）表达量增高。不同品系小鼠对同一过敏原的过敏反应可能存在差异，如赵新凤等[35]对BALB/c和KM两个品系小鼠食物过敏模型进行比较，结果显示，BALB/c小鼠对OVA的敏感性高于KM小鼠。

3.2 基于大鼠模型的蜂花粉致敏性评价与机制研究

敏感品系大鼠能产生较为理想的I型过敏反应，相较于豚鼠和小鼠，大鼠的大小更适于在单体进行分析，并且致敏激发后能产生与人类相似的过敏症状[36]。BN大鼠是高免疫球蛋白应答品系，常作为研究花粉过敏和食物过敏的动物模型。梯牧草花粉与水接触后会释放出含有过敏原的淀粉颗粒，Motta等[37]以此淀粉颗粒溶液作为过敏原，用滴鼻法对BN大鼠进行气管内致敏，滴鼻激发后采集血液和支气管淋巴结。采用酶联免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）对大鼠血清中的梯牧草抗原特异性IgE进行检测，结果显示，特异性IgE表达增高，并且花粉颗粒可诱导淋巴细胞增殖。朱庆龄等[38]采用卵清蛋白作为过敏原，在无佐剂条件下对BN大鼠经口灌胃，建立BN大鼠食物过敏模型。结果显示，与对照组相比，过敏组大鼠血清OVA-IgE和血浆组胺水平显著增高，致敏率为90%。Sun等[39]比较了BN和Wistar大鼠口服卵清蛋白后的过敏反应和临床表现，结果显示，两种品系的大鼠表现出不同的过敏反应和临床表现，并且过敏反应与临床表现之间没有相关性，这些结果表明这两种品系大鼠的免疫学机制可能存在不同。

3.3 基于豚鼠模型的蜂花粉致敏性评价与机制研究

豚鼠具有易感性，是目前常用的过敏动物之一。杨琼梁等[40]用杨树花粉激发豚鼠过敏建立过敏模型，对Dunkin Hartley雄性豚鼠腹腔注射致敏3次后，通过雾化吸入激发。结果显示，模型组豚鼠的鼻黏膜、支气管肺泡灌洗液和肺组织存在炎症细胞浸润，白细胞介素4免疫反应上升，干扰素γ免疫反应下降，血清中IgE、组胺、白三烯B4含量增加。向军俭等[41]以海虾浸提液为过敏原，氢氧化铝为免疫佐剂，建立豚鼠过敏模型。结果显示，豚鼠血清中海虾过敏原的血清IgE和IgG水平显著上升。

尽管利用敏感品系动物构建蜂花粉食源性致敏的动物模型及其机制研究目前尚不健全，但上述花粉及食物致敏的动物模型建立为后续蜂花粉食源致敏性研究奠定了基础，各致敏指标的测定也为蜂花粉致敏机制的探究提供了技术支持。

4 改善蜂花粉致敏性的加工控制技术

4.1 超高压技术

超高压技术可在常温或低温环境下使用，在改变抗原蛋白空间构象的同时，对食品营养成分和风味物质的影响较小，在食品脱敏加工领域应用广泛[42]。例如，大豆中的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白是主要过敏原，Tang等[43]研究发现，在较高的压力（400 MPa或600 MPa）条件下，大豆球蛋白的构象会发生变化。牛β-乳球蛋白是一种重要的牛奶过敏原，Meng等[44]使用高压处理牛β-乳球蛋白，结果表明，其构象因高压处理而改变，致敏性显著下降。

4.2 热处理

热处理可使蛋白质发生共价或非共价相互作用，如交联、聚合、变形和二硫键重排等，在一定程度上破坏了蛋白质的过敏原表位，从而降低致敏性。Burks等[45]在80℃和120℃条件下处理大豆样品60 min，通过ELISA法检验大豆蛋白7S和11S片段的致敏性，发现加热能显著降低7S和11S蛋白结合IgE的能力。Kasera等[46]研究了热处理对豆类蛋白致敏性的改变，结果显示，芸豆、黑豆和花生的可溶性蛋白以及不溶性蛋白的特异性IgE结合能力显著降低。然而，单热处理存在不确定性，在加热过程中可能生成一些新的过敏原表位、蛋白质分子内部的过敏原表位可能暴露，从而可能会增加致敏性。并且，热处理对于食物中的热不稳定性营养成分（如维生素、不饱和脂肪酸等）会产生破坏，相比非热脱敏技术存在一定的弊端。

4.3 辐照

辐照处理可使蛋白质的二硫键、氢键等发生断裂，使蛋白质二级、三级结构发生变化，甚至导致蛋白质脱氢、脱氨，使一级结构发生变化。辐照还可使蛋白质分子内或分子间发生交联，从而降低致敏蛋白质的致敏性[47]。Vaz等[48]用γ-辐射处理小麦胚芽凝集素（wheat germ agglutinin，WGA），发现WGA的过敏性抗原表位在高剂量辐射后活跃性降低，同时也发现经10 kGy处理后的小麦胚芽凝集素的结构发生了变化，其呈折叠且无定形聚合状态，证明γ-辐射可降低小麦的致敏性。然而，目前消费者对辐照食品存在排斥心理，辐照食品的食用安全性也存在争议，因此开发新型、高效、安全的脱敏技术十分必要。

4.4 生物法

4.4.1 酶法

蛋白酶催化蛋白质水解，可破坏具有过敏原表位的片段，从而显著降低过敏原蛋白的致敏性。Lakshman等[49]从红曲菌中提纯出两种酸蛋白酶，采用单一酶法和复合酶法酶促制备乳清蛋白浓缩物的水解产物。结果表明，红曲霉酸蛋白酶能够有效地水解两个主要的牛乳过敏原，降低牛乳乳清蛋白的致敏性。李育强等[50]建立了一种花粉和蜂花粉破壁、脱敏、提取水溶性成分的方法，使用糖苷酶、蛋白酶和肽酶处理，在脱敏同时能保留更多的营养成分并改善口感。

4.4.2 发酵法

微生物作用可使蛋白质分解变性，从而达到降低过敏性的目的。相比于其它方法，发酵处理后的食品中的蛋白质被分解，有助于吸收，同时对其它营养成分影响较小[51]。Biscola等[52]研究评估了蛋白水解菌株粪肠球菌VB43水解豆浆中存在的主要致敏蛋白的能力，结果表明，β-伴大豆球蛋白被完全水解，大豆球蛋白被水解为酸性多肽。

生物法包括酶法和发酵法，相比超高压技术、热处理和辐照而言，更加高效、安全，在花粉和蜂花粉产品开发领域已有所应用，然而目前尚缺少对酶或发酵处理后蜂花粉致敏性评价的科学手段，因此对于处理参数条件的优化和控制无法标准化实施。健全蜂花粉致敏性评价体系、开发标准化脱敏方法是亟需解决的问题。