马尾松叶片挥发物组成及其对松墨天牛有触角电生理反应的活性成分鉴定*

赖 略 邹学冰 徐金柱 秦长生 杨 华 田龙艳 张春花 邱华龙

(1.河源市森林病虫害防治服务中心，广东 河源 517000; 2.河源市源城区林业综合服务中心，广东 河源517000；3.广东省林业科学研究院/广东省森林培育与保护利用重点实验室，广东 广州 510520）

松墨天牛Monochamus alternatus是我国松林最为严重的一种病害松材线虫病的主要传播媒介之一[1]。松墨天牛在广东主要危害马尾松Pinus massoniana，同时也危害云南松P. yunnanensis、雪松Cedrus deodara以及黑松P. thunbergii等其它多种松科植物[2]。松墨天牛幼虫可蛀食树干韧皮部及木质部，阻断和破坏输导组织，影响植物生长所需的水分和养分运输，严重阻碍树木生长。此外，松墨天牛成虫羽化后补充营养阶段造成的植物伤口促使松材线虫传入健康松树，从而引发松材线虫病，使松树发病继而枯死[3-4]。松墨天牛成虫传播的松材线虫病是我国重大的林业植物疫情之一，它能在较短时间内引发大面积松林感病和死亡，对我国广大松林资源构成严重威胁。

对于松材线虫病的防治，目前主要依靠人工方法及时清理病枯死松树，并在松墨天牛羽化盛期喷洒噻虫啉等药剂防治这种媒介昆虫[5-7]。这些防治方法需要投入巨大的人力、物力和财力，虽然能暂时阻止松墨天牛的快速扩散蔓延，但是不能有效对松材线虫进行长期的可持续控制。一旦财政经费投入减少，松材线虫病又很快死灰复燃，不断扩散蔓延。因此，亟需探索研究其它防治方法对其进行可持续性控制。

天牛主要利用触角通过寄主植物释放的挥发物进行远距离定位寄主植物，然后通过聚集信息素寻找配偶并进行交配繁殖[8-9]。根据松墨天牛聚集信息素主要成分开发的松墨天牛引诱剂已在全国松墨天牛监测和防治中得到广泛应用。聚集信息素引诱剂中加入寄主植物信息素对天牛具有引诱活性的挥发物能够扩大对天牛的作用距离，从而提高引诱剂的引诱效果[8]。虽然利用松墨天牛聚集信息素十一烷氧基乙醇诱杀松墨天牛已得到广泛应用[10]，但是目前马尾松挥发物中对松墨天牛具有生理活性的成份尚不清楚，而且无添加到引诱剂配方中的报道。因此，本研究将分析鉴定马尾松叶片挥发物成份，并测试挥发物成份对松墨天牛雌雄成虫的触角电生理反应，以期为增强现有松墨天牛诱芯的引诱活性提供参考。

1 材料与方法

1.1 松墨天牛采集与饲养

2021年4-10月在广东省河源市源城区松林内通过挂放松墨天牛诱捕器进行诱集成虫，每天下午16：00时将诱集罐中的天牛放入养虫笼中带回实验室饲养。实验室饲养条件：温度（25±1）℃、相对湿度 (45 ± 5 )%、光周期L : D=12 h : 12 h。每天用新鲜的马尾松枝条饲喂。

1.2 松墨天牛对马尾松植物的偏好选择

使用自制的Y型嗅觉仪（主臂长30 cm、分支臂长25 cm、两分支臂角度120。，内径5 cm）测定松墨天牛对寄主植物马尾松的选择行为。将气泵进气口通过橡胶软管连接一根活性炭过滤管（内径6 mm，外径8 mm），吸附空气中的杂质。气泵出气口通过聚四氟乙烯管连接装有超纯水的洗气瓶，对泵入的空气进行湿润。然后再用聚四氟乙烯管连接至装有寄主植物的气味瓶，随后气味瓶再分别连接Y型嗅觉仪的两臂。在Y型嗅觉仪的柄端放入松墨天牛，观察并记录松墨天牛对寄主植物气味的选择行为。选择标准为当试虫沿着柄端爬行到两臂交接处，然后选择一臂超过臂长的1/2并且停留时间超过1 min，即判定为对该臂连接的寄主植物做出偏好选择；如果试虫停留在嗅觉仪柄端处超10 min，但仍没做出选择，则确定其为无反应。每15头虫作为一组，测定一组试虫后用丙酮和蒸馏水冲洗后擦干，继续测定，总共测定4组。

1.3 马尾松叶片挥发物的提取与鉴定

将干净的马尾松嫩叶叶片30 g放在正己烷（HPLC纯）中，浸泡20 min以收集叶片的挥发性物质，用无水Na2SO4除去样品中的水分，用带过滤尼龙膜的一次性移液针将液体样品转移到2 mL的棕色样品瓶内，并用氮吹仪中的高纯氮气将样品浓缩至200 μL, 保存在-20 ℃冰箱内待用。用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS：安捷伦7890B-5977B）对样品化合物进行分析鉴定。

使用的气相色谱仪为安捷伦7890B，色谱柱型号为HP-5ms毛细管色谱柱，色谱柱长度*内径*膜厚= 0.25 mm*30 m*0.25 μm。 色谱柱柱流量为1mL/min，载气为99.999%高纯氮气。进样口温度为220 ℃，不分流进样。柱箱程序升温程序为：40 ℃保留 2 min，然后以15 ℃/min升至235 ℃。后运行温度为270 ℃，时间为6 min。

质谱条件为：传输线温度280℃，离子源温度230℃，四级杆温度150 ℃，溶剂延迟4 min，离子扫描范围50-500 m/z。使用C7-C40的正构烷烃混合物标准品计算目标化合物的相对保留指数(Retension Index, RI)，RI的计算公式参照文献中的公式计算[11]。同时根据NIST17谱库中的特征离子碎片信息及化合物的保留指数对化合物进行鉴定。选取Masshunter软件中NIST17普库比对中匹配值最大的化合物（匹配值需大于等于85%）为鉴定化合物，当最大匹配度＜85%时，将该化合物定性为未知化合物。对峰面积＞最大峰面积的1%的目标峰进行积分，并计算其相对百分含量。

1.4 松墨天牛对马尾松松挥发物的触角电生理反应

用气象色谱-触角电位联用仪(GC-EAD)测试松墨天牛雌、雄成虫对寄主植物挥发物的触角电生理反应。气象色谱端的条件与上述GC-MS中的相同。利用EAG昆虫触角电位记录仪（荷兰Syntech公司）测定挥发物引起昆虫的触角电生理反应大小。首先沿松墨天牛触角基部将触角剪下约2 cm，并在触角尖部用小刀将表皮切开约0.5 mm的细口，然后将处理好的触角连接到触角电位仪的两个玻璃电极上。手动进样2 μL，不分流进样。GC和EAD分流平板的样品分流比为1 : 1，测试松墨天牛雌雄成虫对寄主植物气味的电生理反应。每次实验重复6根触角以上，当对松墨天牛重复3次以上都有反应的化合物质则为活性化合物。

1.5 数据处理

利用SPSS软件中非参数检验的卡方对选择寄主植物的松墨天牛数量进行差异显著性分析（P=0.05）。

2 结果与分析

2.1 松墨天牛对寄主植物气味的行为选择

松墨天牛对寄主植物气味与空白对照的选择结果表明（图1），78.33%的天牛选择寄主植物气味（c2=27.65，df = 1，P＜ 0.001），说明马尾松叶片气味对松墨天牛均具有显著的吸引作用。

图1 松墨天牛对马尾松寄主气味的行为选择Fig.1 Odor preferecne of Monochamus alternatus adults to volatiles of Pinus massoniana plant leaves

2.2 马尾松叶片挥发物鉴定

通过GC-MS以及NIST17谱库检索分析马尾松叶片中总共检测到22种挥发性化合物（图2、表1）其中萜烯类物质14种，醇类物质5种，羧酸类物质和酯类物质各1种，有1个未鉴定化合物。在上述挥发物中，相对含量超过8%的均为萜烯类化合物，其中β-蒎烯的相对百分含量最高，达（28.68±0.67.0）%，其次为α-蒎烯，含量达（21.03±5.08）%，然后依次为D-吉玛烯（13.60±1.60）%、β-水芹烯（8.85±0.97）%以及β-石竹烯（8.24±5.08）%。

表1 马尾松叶片挥发物组分及相对含量Table1 Chemicals and relative contents of volatiles from Pinus massoniana leaves

图2 马尾松叶片挥发物的TIC总离子流Fig.2 Total Ion chromatogram of volatiles of Pinus massoniana leaves

2.3 马尾松叶片对松墨天牛的触角电位反应

GC-EAD检测结果表明（图3），马尾松叶片挥发物中有6种化合物能够引起松墨 天牛雌、雄成虫的触角电生理反应。通过保留指数和GC-MS NIST谱库鉴定比较，确定这6种物质中5种为萜类化合物，分别为α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯、β-石竹烯和D-吉玛烯，1种为酯类物质乙酸龙脑酯。松墨天牛雌雄成虫之间对马尾松挥发物有触角电位反应的挥发物种类没有差别。

图3 松墨天牛雌、雄成虫对马尾松叶片挥发物的触角电生理反应Fig. 3 Electroantennogram of antennae of female and male Monochamus alternatus adults to volatiles of Pinus massoniana leaves

3 讨论

目前生产上对松材线虫病的防治措施主要包括清理病枯死松树、喷洒化学农药防治媒介昆虫松墨天牛，以及利用诱捕器诱杀松墨天牛[6]。喷洒化学农药严重污染林业生态环境，人工清理病枯死树需耗费大量人力和物力，因此这些防治方法均存在较大弊端。诱捕器诱杀天牛是一种较为环保的监测和控制松墨天牛种群密度的方法。然而，以松墨天牛的聚集信息素十一烷氧基乙醇为主要成分的诱芯制作的诱捕器的诱杀距离较短，对于长距离诱杀仍然是其短板。寄主植物挥发物在天牛远距离识别寻找寄主及产卵场所等行为过程中起关键作用[12-14]。研究松墨天牛对寄主植物挥发物的偏好行为及触角电生理反应，不仅对于松墨天牛有引诱活性的挥发物筛选有帮助，而且对提高现有诱捕器的引诱范围和效果具有潜在作用。

Y型嗅觉仪选择性试验表明，78.33%的松墨天牛选择具有马尾松气味的一端，说明马尾松叶片挥发物对松墨天牛的偏好选择行为具有调控作用。马尾松挥发物中主要为一些烯烃类的化合物，主要包括β-蒎烯、α-蒎烯、D-吉玛烯、β-水芹烯以及β-石竹烯。这些绿叶挥发性气味组成与现有报道较一致[15-16]。含量较多的上述5种化合物均可和引起松墨天牛雌雄成虫明显的触角电生理反应。宁眺等[17]对5种不同生理状态(健康、人为物理损伤、饵木、取食和产卵)的马尾松的萜烯化合物进行了分析，结果表明不同生理状态下萜烯化合物的相对含量会发生显著变化，如随着饵木的衰弱进程，α-蒎烯的相对含量显著减少而β-蒎烯的含量显著增加，两者比例的变化可能是马尾松寄主树势衰弱程度变化的一个重要信号。此外，乙酸龙脑酯天然存在于冷杉Abies fabri油以及一些松科植物挥发性油中，在马尾松叶片中的相对百分含量为（2.47±0.46）%，但是乙酸龙脑酯也可引起松墨天牛的触角反应。本研究发现马尾松植物中存在α-毕橙茄醇两种异构体，但由于缺乏标准品，未能对这两个异构体进行准确的鉴别。

通常萜烯类化合物是植物绿叶中产生芳香气味的主要物质，对植物害虫及其天敌的行为具有非常重要的调节作用[16,18]。α-蒎烯和β-蒎烯广泛存在于松树和杉木中，进一步开展室内及田间引诱试验对筛选松墨天牛诱芯增效剂，提高现有诱芯的引诱效率有积极作用。