薯莨单宁的提取及其抑菌活性研究*

李落叶 杨晓朱 雷梦英 梁传冠 何旭君 黄少彬

（1.广东生态工程职业学院/植物有害生物防控与生物环境健康应用技术协同创新中心，广东 广州 510520；2.惠州泰合新创科技有限公司，广东 惠州 516000）

薯莨Dioscorea cirrhosa是薯蓣科多年生藤本植物，生于山坡、路旁、林中，盛产于我国广东、广西、贵州、湖南、浙江等地。薯莨块茎含有丰富的单宁，具有抑菌、止血功效，医药领域被用于治疗内伤吐血、外伤出血、胃炎、肠炎等症[1]。在纺织印染领域，薯莨浸汁被广泛用于染皮制革、染布等工艺，是国家地理标志产品——香云纱制作过程中的染色原料。

单宁是一类广泛存在于植物界的酚类化合物，是高等植物体内的次级代谢产物，其具有丰富多样的结构类型和各种生物活性。研究发现，单宁类化合物对细菌、真菌、病毒等多种微生物都有很强的抑菌作用[2-5]。据报道，番石榴Psidium guajava叶片提取物（主要成分为单宁）对白菜软腐病菌有抑制作用，能延缓白菜软腐病的发生[6]。多种植物的单宁提取物对烟草花叶病毒（TMV）具有明显的体外抑制作用[7]。薯莨块茎中单宁含量非常高，为11%～38%之间[8]，因此，薯莨具备开发天然杀菌剂的潜力。

本试验以薯莨和薯莨渣为原料，比较了丙酮浸提和乙醇浸提两种方法提取薯莨单宁的产物得率，并采用体外抑菌试验测定薯莨提取物对供试细菌和真菌菌株的抑菌活性，为进一步研究开发薯莨植物源杀菌剂、充分利用薯莨资源、减少资源浪费奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 薯莨原料 来自惠州大岚的野生薯莨块茎，经洗净、晾干后，切成长宽约5 mm × 5 mm、厚度2 mm至5 mm的小块，分成两组，一组直接用40℃烘箱烘干备用。香云纱制作过程中，需要用到薯莨水对织物进行浸染[9-10]，过水后剩下的薯莨渣被当做废弃物随意堆放、焚烧处理，未得到有效利用。为了充分利用资源、减少浪费，研究薯莨渣中生物活性成分单宁的含量情况，本研究模拟香云纱制作中薯莨渣的生成过程，将另一组薯莨先过两次水，然后沥干得薯莨渣，再用40℃烘箱烘干备用。

1.1.2 供试菌株 所用菌株都为本研究室从患病植物分离保存。真菌菌株3个：引起猴耳环Pithecellobium clypearia枝干病害的炭疽病菌（暂定名为H30，Colletotrichumsp.）、拟茎点霉（暂定名为H63，Phomopsissp.），引起猴耳环叶斑病的拟盘多毛孢属真菌（暂定名为H69，Pestalotiopsissp.）；以及来自广藿香Pogostemon cablin青枯病病株的细菌菌株1个（暂定名为GHB2，Ralstoniasp.）。

1.1.3 培养基 本试验真菌、细菌均采用马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：200 g 马铃薯煮汁，加入20 g葡萄糖、20 g 琼脂粉，蒸馏水定容到1 000 mL，灭菌，冷却后，制成固体平板培养基。

1.2 方法

1.2.1 薯莨单宁提取及含量测定 比较了丙酮浸提和乙醇浸提两种方法。称取备用的干薯莨或薯莨渣，用60%丙酮或75%乙醇按照料液比1 : 10在60 ℃下浸提3 h，过滤，滤液用Heidolph Laborota 4000旋转蒸发仪旋蒸，蒸发条件为50 ℃、0.08 MP，获得的浸膏在40 ℃下烘干成粉状。

提取物得率计算：提取物得率 = （浸出物干粉质量 ÷ 干薯莨质量）× 100%

提取物中单宁含量测定：Follin酚法，具体参照林倩等的方法[11]。

1.2.2 药剂的准备 称取适量丙酮浸提法获得的薯莨提取物干粉，用50%甲醇溶解，分别配制成200、150、100、50、10、5 mg/mL溶液；阳性对照采用华诺生物科技有限公司生产的噁霉灵，用50%甲醇稀释成浓度为3 mg/mL的溶液；阴性对照为50%甲醇溶液。

1.2.3 薯莨提取物对菌丝生长的影响 采用菌丝生长速率法。分别取150、100、50 mg/mL的薯莨提取物各0.2 mL，均匀涂布于PDA平板培养基，以涂布3 mg/mL噁霉灵和50%甲醇0.2 mL作为对照。用灭菌的尖头镊子，在新鲜活化的病原菌菌落边缘小心夹取极小量菌丝，接种到上述含有药剂的平板培养基，26 ℃下暗培养3 d，用十字交叉法测量菌落直径。每个处理重复3次，取平均值。

菌丝抑制率 = （对照组菌落直径－试验组菌落直径 ) ÷对照组菌落直径 × 100% 。

1.2.4 细菌悬液的制备 保存的菌液先划线活化培养，24 h后挑取单菌落用无菌水稀释后涂平板，继续培养24 h，无菌水洗脱平板上的新鲜菌苔，并制成悬浮菌液，菌液浓度调整为OD600 = 0.1，现用现配。

1.2.5 薯莨提取物抑制细菌能力的测定 采用滤纸片法。用打孔器将滤纸制成直径为 6 mm的圆纸片,高压锅灭菌内121 ℃灭菌20 min后烘干，取0.1 mL新鲜菌液均匀涂布在PDA固体平板培养基上，用无菌镊子夹取滤纸片平铺于含菌平板上，每皿放4个滤纸片，使各纸片之间均匀间隔一定距离，在每个纸片上滴加5 μL药剂，以滴加50%甲醇为阴性对照，设3次重复。28 ℃下暗培养24 h，十字交叉法测量各处理的抑菌圈直径，取平均值。

2 结果与分析

2.1 薯莨提取物得率及单宁含量

按照1.2.1的方法，薯莨提取物得率及有效成分含量如表1。从表1可以看出，采用丙酮浸提法时，薯莨产物得率和产物中单宁含量都明显高于乙醇提取法，因此，丙酮提取法更适合提取薯莨单宁。同样的提取方法下，薯莨渣的提取物得率比薯莨提取物得率低约50%，其原因可能是由于过水后薯莨中部分单宁等物质随水流失，所以产物变少，但产物中单宁含量仍然很高，与薯莨提取物相近，说明薯莨渣提取物同样具备抑菌潜力。

表1 不同条件下提取物得率及其单宁含量Tab.1 The output rate of extracts and tannic acid content in extracts under different extraction method

2.2 薯莨提取物对真菌的抑制作用

测试了薯莨丙酮提取物（下面以“T”表示）对炭疽病菌H30、拟茎点霉H63和拟盘多毛孢属真菌H69的抑制活性。噁霉灵是当前广泛应用的真菌杀菌剂，本实验设置了3 mg/mL噁霉灵为阳性对照。结果表明，T液对H30有明显的抑制作用，但抑制程度低于噁霉灵（图1. a, b, c）；对H63菌丝的生长也有明显抑制，浓度在100 mg/mL时的抑制程度接近3 mg/mL噁霉灵（图1. d, e,f），而对H69无抑制作用(图1. g, h, i)。

图1 薯莨提取物对来自猴耳环的炭疽病菌H30、拟茎点霉H63和拟盘多毛孢属真菌H69的抑制活性Fig.1 The antimicrobial activity of the extracts from Dioscorea cirrhosa to a species of Colletotrichum H30, a species of Phomopsis H63 and a species of Pestalotiopsis H69 from Archidendron lucidum

不同浓度的T液对H30和H63均有抑制活性，抑制效果随浓度增大而增强，100 mg/mL的T液对H30的菌丝抑制率达46.2%；对H63的菌丝抑制率也达到31.9%，接近3 mg/mL噁霉灵的抑制率，150 mg/mL 的T液对H63的菌丝抑制率略高于3 mg/mL噁霉灵；测试浓度下，T液没有表现出对H69的抑制效果（表2）。

表2 薯莨提取物对猴耳环真菌病原菌丝生长的影响Tab.2 The effects of Dioscorea cirrhosa extracts on three pathogenic fungi of A. lucidum

2.3 薯莨提取物对细菌的抑制作用

抑菌实验结果表明，薯莨提取物对广藿香青枯病菌株GHB2有显著抑制效果，浓度越大抑菌效果越好，浓度达到50 mg/mL时，抑菌圈直径14.3 mm，抑菌效果明显（图2a），低浓度下抑菌效果较弱，浓度为10 mg/mL时，抑菌圈直径10 mm（图2b）；5 mg/mL时，抑菌能力极微弱，但与空白对照相比，仍然能观察到很小的抑菌圈（图2c，表3）。

表3 不同浓度薯莨提取物对广藿香青枯病菌GHB2的抑菌活性Tab.3 The antibacterial activity of different concentrations of Dioscorea cirrhosa extracts to Ralstonia solanacearum of P. cablin

图2薯莨提取物对广藿香青枯病菌GHB2的抑菌效果Fig.2 The antibacterial activity of Dioscorea cirrhosa extracts to Ralstonia solanacearum of Pogostemon cablin

3 结论与讨论

提取植物活性成分的方法很多，不同植物原料、不同溶剂，不同料液比、不同浸提温度和浸提时间等都会对提取物的得率和成分造成影响[12-14]。利用乙醇和丙酮浸提是两种常用方法，有研究表明丙酮为溶剂提取薯莨单宁时，浓度以60%为好[10]，以乙醇为溶剂时，浓度在80%左右为佳[11]。本研究比较了60%丙酮和75%乙醇对薯莨单宁的提取效率及提取物中单宁含量的差异，发现不管是薯莨还是薯莨渣，以60%丙酮浸提获得的产物得率更高、产物单宁含量也更高。因此，在本研究采用的提取方法中（见1.2.1），用丙酮浸提薯莨单宁比用乙醇浸提更合适。近期有报道用“乙醇+甘油”和“甲醇+甘油”等复合溶液为溶剂提取植物单宁，大大提高了产物得率[15]，未来可考虑利用类似的办法进一步改进提取方法，提高产物得率。

猴耳环和广藿香都是重要中药材，种植过程中病害较多，对药材产量和质量影响大，药材的用途决定了其病害的防治要更加注重绿色、无公害，开发植物源杀菌剂防治中药植物病害具有良好的应用前景。本研究选择了分离自猴耳环病株的3种真菌：炭疽病菌、拟茎点霉、拟盘多毛孢菌，这些病菌能引起多种植物病害，具有代表性。测试了薯莨提取物对其抑制活性，结果显示，薯莨提取物对炭疽病菌和拟茎点霉的菌丝生长有良好的抑制效果，说明薯莨提取物的确具备开发植物源杀菌剂的潜力，也可以考虑与其它药剂进行混配，形成互补，拓宽杀菌谱。研究也发现薯莨提取物对拟盘多毛孢真菌无作用，甚至在较低浓度下对拟盘多毛孢菌丝有轻微促生作用，说明其对真菌生长的抑制具有选择性。对广藿香青枯病菌的抑菌实验结果表明，50 mg/mL的薯莨提取物对该菌具有良好抑制效果。导致植物青枯病的菌群复杂、变异多[16]，要将薯莨提取物开发成防治青枯病的药剂，还需要测定其在植株上的实际防治效果。无论如何，薯莨提取物至少能够抑制部分青枯病菌株的生长繁殖速度，可考虑制成无毒副作用的病害防治辅助剂，减轻病情，降低损失。

我国薯莨资源十分丰富，自然分布范围广，主要分布于南方中低海拔山区，广东和广西为薯莨的最高适生区，是当前最密集的分布区域，在未来气候变化的影响下，薯莨有进一步向最高适生区即广东、广西两省集中的趋势[17]。目前，薯莨最多用于香云纱的制作工艺中,每到秋冬季节，数万吨的薯莨废渣经风干后直接被焚烧处理[18]，资源浪费和环境污染较大。为充分利用本地薯莨资源，减少浪费，减轻环境污染，本研究试图从农药开发的角度探索薯莨利用的新途径。研究发现，泡过水的薯莨渣中仍然含有大量单宁，提取物的得率是薯莨块茎提取物得率的50%左右，提取物中单宁含量与薯莨提取物相仿，因此，薯莨渣提取物与薯莨提取物一样具备开发成植物源农药的潜力。未来可从提高提取效率、降低提取成本方面进一步研究薯莨单宁的大规模提取工艺，为实现薯莨资源的规模化利用奠定基础。

本研究明确了薯莨提取物对多种重要植物病原菌具有良好的直接抑菌效果，薯莨渣中亦提取到有效成分含量相同的提取物，对充分利用薯莨资源研发新型植物源杀菌剂、减少薯莨资源浪费具有参考价值。