补肾养精颗粒灌胃对早发性卵巢功能不全大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的抑制作用及其机制

于潇，王玉超 ，刘金星，郑伟，张芳，刘鹏飞

1 山东中医药大学附属医院妇科，济南 250014；2 青岛中西医结合医院妇科；3 山东中医药大学教务处；4 山东中医药大学附属医院生殖与遗传科

早发性卵巢功能不全（POI）是指女性在40岁以前出现卵巢功能减退，主要表现为月经异常和生育能力下降［1］。POI 的发生机制可能与卵泡颗粒细胞凋亡引起卵泡异常闭锁、卵巢功能损害有关。Hedgehog（Hh）信号具有进化保守性，在细胞增殖及分化过程中起先导作用［2］。研究表明，Hh 信号通路的关键基因Hh、肿瘤抑制基因（Ptch）和原癌基因（Smo）、锌指蛋白1（Gli1）存在于哺乳动物卵巢颗粒细胞、卵泡膜细胞及卵巢间质中［3］，可以调控Bax、Bcl-2等靶基因的表达，抑制卵巢颗粒细胞凋亡。补肾养精颗粒是由本团队自拟的治疗POI 的中药方，前期临床及基础研究证实，该方能够促进卵泡发育及促排卵，改善卵巢内分泌功能［4-5］。动物实验显示，补肾养精颗粒可通过调节凋亡相关基因Bcl-2、Bax、PI3K、AKT 表达，抑制卵泡颗粒细胞凋亡，从而改善POI 大鼠卵巢功能［6］。但是，补肾养精颗粒是否能够通过调控Hh 信号通路来抑制卵巢颗粒细胞凋亡尚不明确。2019 年 7 月—2022 年 6 月，我们以Hh通路为调控颗粒细胞凋亡的作用靶点，观察补肾养精颗粒对POI 大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的抑制作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 8 周龄SPF 级雌性SD 大鼠90只，体质量（190±20）g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。饲养于山东中医药大学附属医院动物实验中心，SPF级屏障环境，温度20～24 ℃，湿度50%～60%，适应性喂养2周后用于实验。

1.1.2 药物与试剂 补肾养精颗粒组成：菟丝子18 g、熟地黄12 g、枸杞子15 g、覆盆子9 g、当归12 g、白芍12 g、川芎9 g、醋香附12 g、炒枳壳12 g、炙淫羊藿12 g、盐知母12 g、盐车前子6 g、川牛膝15 g、党参12 g、益母草15 g、制五味子9 g。中药饮片剂量为192 g，经换算相当于配方颗粒33.3 g，取33.3 g中药免煎颗粒（购自山东中医药大学附属医院中药房）置于烧杯中，加入95 mL 纯净水搅拌后加热溶解，配制成补肾养精颗粒中剂量灌胃药液，4 ℃保存。雷公藤多苷片为远大医药黄石飞云制药有限公司产品，戊酸雌二醇（补佳乐）为拜耳医药保健有限公司产品，孕马血清促性腺激素（PMSG）为北京索莱宝科技有限公司产品。戊二醛购自北京雷根生物技术有限公司，PBS 缓冲液、红细胞裂解液、Gli1 抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，丙酮溶液购自南京试剂股份有限公司，DAB 显色剂购自中杉金桥生物技术有限公司，Annexin V-FITC/PI试剂盒购自Elabscience公司，Western一抗稀释液购自碧云天生物技术有限公司，Bax、Bcl-2、Shh 抗体购自Proteintech 公司，Ptch1抗体购自Affinity公司。

1.1.3 实验仪器 病理切片机购自德国LEICA 公司，透射电镜购自日本日立公司，离心机购自上海安亭科学仪器厂，Mini-PROTEAN Tetra 电泳仪、Mini Trans-Blot 转印仪购自Bio-Rad 公司，化学发光成像系统购自上海培清科技有限公司，微量分光光度计购自杭州奥盛仪器有限公司，凝胶成像仪购自上海天能科技有限公司。

1.2 动物分组与模型制作 将大鼠按照随机数字表法分成空白组15 只和模型组75 只，模型组给予50 mg/（kg·d）雷公藤多苷混悬液灌胃制备 POI 模型，空白组给予0.9%氯化纳注射液2 mL/d 灌胃，每天1 次，连续14 d。以大鼠动情周期紊乱为造模成功。

1.3 干预方法 造模结束后，将模型组分为模型对照组、补佳乐组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组，每组各15只。参照人与动物之间药物剂量换算方法［7］，中药低、中、高剂量组分别给予补肾养精颗粒1.75、3.5、7.0 g/（kg·d）灌胃，补佳乐组给予补佳乐0.1 mg/（kg·d）灌胃，空白组和模型对照组继续灌服0.9%氯化纳注射液，连续给药15 d。

1.4 大鼠卵巢颗粒细胞凋亡状态观察 末次给药24 h 后，每组分别随机取6 只大鼠，给予PMSG 50 IU皮下注射进行促排卵干预，以提取卵巢颗粒细胞。48 h后将大鼠脱颈椎处死，75%乙醇浸泡消毒，取出双侧卵巢。在解剖镜下用1 mL 注射器针头刺破卵巢表面卵泡，使颗粒细胞释放，吹打分散成单个悬浮细胞，1 000 r/min 离心 5 min，弃上清。加入 3 倍体积的红细胞裂解液，冰上放置15 min。在避光条件下依次加入 5 µL Annexin V-FITC 染液和 5 µL PI 染色液，室温避光孵育20 min。使用FlowJo7.6 软件，以FITC 为横坐标、PI 为纵坐标绘制双色散点图，计算细胞碎片、晚期凋亡细胞、早期凋亡细胞及正常细胞的百分率。

1.5 大鼠卵泡超微化结构观察 末次给药后24 h，各组剩余9 只大鼠给予10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，取出双侧卵巢。右侧卵巢固定于2.5%戊二醛中，在解剖镜下完整分离出卵巢表面较大的卵泡，PBS 缓冲液漂洗，固定液固定，丙酮梯度脱水，渗透后包埋在包埋板中进行聚合处理，制成50～60 nm 厚度的超薄切片。采用柠檬酸铅和醋酸铀双染色法，在透射电子显微镜下观察卵泡的超微化结构。左侧卵巢加入液氮，-80 ℃冰箱保存，用于检测凋亡相关蛋白。

1.6 大鼠卵巢组织Hh 信号通路关键基因Shh、Ptch1、Gli1 及凋亡相关基因 Bax、Bcl-2 蛋白表达检测 取冻存的大鼠左侧卵巢，加入裂解液制备组织匀浆，采用BCA法测定蛋白样品浓度定量。按照蛋白体积+PBS与蛋白上样缓冲液4∶1的体积比例配制蛋白体系，充分混匀，95 ℃水浴锅中加热8 min 使蛋白变性。SDS-PAGE 电泳分离后转移至PVDF 膜上，根据目的蛋白的分子量选择转印时间（220 mA，1～2 h）。5%TBST 牛奶溶液封闭1 h，加入GAPDH（1∶3 000）、Shh（1∶1 000）、Ptch1（1∶1 000）、Gli1（1∶1 000）、Bax（1∶2 000）、Bcl-2（1∶1 500）一抗，4 ℃过夜。冲洗后放入1∶5 000的二抗溶液中，冲洗后加化学发光试剂显影，分析蛋白灰度值，计算目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件，计量资料以表示，均数比较前进行正态性及方差齐性检验，符合正态分布时多组间比较采用单因素方差分析，符合方差齐性时组间比较采用LSD 和SNK分析；计数资料用例表示，采用Fisher 确切概率法进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡状态比较 见表1。

表1 各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡状态对比（%，）

表1 各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡状态对比（%，）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与补佳乐组比较，▲P＜0.01；与中药低剂量比较，■P＜0.05，■■P＜0.01；与中药高剂量组比较，□P＜0.01。

正常细胞比例81.80± 4.76 24.40± 8.45*37.30 ± 4.98*△△□45.68 ± 2.81*△△▲■□57.09 ± 8.54*△△▲34.80±12.57*△组别空白组模型对照组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组补佳乐组n 6 6 6 6 6 6细胞碎片率0.57±0.32 0.84±0.25 0.88±0.34 0.89±0.29 0.98±0.63 0.62±0.35晚期凋亡率9.57± 3.61 56.60±10.32*42.56 ± 6.64*△29.96 ± 4.95*△△▲■■31.30 ± 8.09*△△▲■■41.26 ± 7.91*△早期凋亡率7.81± 4.55 21.90±10.21*22.14±12.97*□24.06 ± 6.55*□10.37 ± 4.86△△▲25.00±11.69*

2.2 各组大鼠卵泡超微化结构变化 空白组卵母细胞及颗粒细胞形态规则，细胞器结构正常，线粒体呈圆形或椭圆形，内质网成簇排列，高尔基复合体及溶酶体结构完整。模型对照组卵母细胞形态欠规则，细胞核固缩，颗粒细胞形态欠规则，见凋亡相，细胞器结构异常且数量偏少，线粒体基质疏松，偶见内质网及高尔基复合体，溶酶体数量增多。与模型对照组相比，中药低剂量、补佳乐组卵母细胞及颗粒细胞形态欠规则，部分细胞见凋亡相，细胞器数量偏少，线粒体轻度水肿，内质网稀疏，溶酶体数量较模型组减少。中药中剂量、高剂量组卵母细胞形态正常，细胞膜完整，基本接近空白组，颗粒细胞形态规则，细胞器数量较空白组减少，线粒体部分水肿，内质网及高尔基复合体减少；溶酶体数量较空白组增多。

2.3 各组大鼠卵巢组织Shh、Ptch1、Gli1 及Bax、 Bcl-2蛋白表达比较 见表2。

表2 各组卵巢组织Shh、Ptch1、Gli1及Bax、Bcl-2蛋白相对表达量比较（）

表2 各组卵巢组织Shh、Ptch1、Gli1及Bax、Bcl-2蛋白相对表达量比较（）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与补佳乐组比较，▲P＜0.05；与中药低剂量比较，■P＜0.05，■■P＜0.01。

组别空白组模型对照组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组补佳乐组Bcl-2 1.00±0.00 0.29±0.17*0.43±0.19*△0.51 ± 0.15*△△0.57 ± 0.16*△△▲■0.41±0.11*△n 9 9 9 9 9 9 Shh 1.00±0.00 0.21±0.11*0.44 ± 0.22*△△0.57 ± 0.16*△△▲■■0.61 ± 0.17*△△▲■■0.41±0.13*△Ptch1 1.00±0.00 0.28±0.13*0.45 ± 0.14*△△0.51 ± 0.21*△△0.56 ± 0.19*△△0.43±0.15*△Gli1 1.00±0.00 0.27±0.11*0.41 ± 0.10*△△0.55 ± 0.17*△△▲■0.58 ± 0.14*△△▲■0.38±0.12*△Bax 1.00±0.00 1.86±0.49*1.51±0.32*△1.43 ± 0.31*△△1.34 ± 0.28*△△▲■1.59±0.24*△

3 讨论

目前POI 的发生机制尚不明确，西医主要从遗传因素、医源性因素、免疫因素、环境因素等方面进行研究。大量研究表明，卵泡颗粒细胞的过度调亡通过卵泡闭锁的形式引起POI，而引起卵巢颗粒细胞凋亡的发生发展机制十分复杂，内分泌紊乱、凋亡基因与表观遗传调控失常、免疫异常等相关因素均可能参与其中。常规激素补充治疗可以建立正常的月经周期，但无法改善卵子的质量及妊娠结局。2017 年发布的早发性卵巢功能不全的临床诊疗中国专家共识指出，中药可做为一种治疗POI 的非激素药物［8］。POI 属于中医学“月经后期”“月经过少”“闭经”“不孕”等范畴，系七情内伤、生活失度及先天禀赋不足等原因引起的脏腑功能失调。《素问·六节藏象论》曰：“肾者主蛰，封藏之本，精之处也。”《医学正传》记载：“月经全赖肾水施化，肾水既乏，则经血日以干涸。”因此，多数中医学者认为肾虚是POI 发生的主要病机，补肾为其治疗大法。

补肾养精颗粒是由本研究团队负责人刘金星教授所创制，由四物汤、五子衍宗丸及二仙汤组方加减而成。方中菟丝子补肾益精，熟地黄补血养阴，填精益髓，共为君药。枸杞子、覆盆子益肝肾明目，当归、白芍、川芎与熟地黄合为四物汤，上述诸药合用滋阴补血，养血填精，为臣药。五味子可引气入肾故补肾之力更强；车前子能泄肾浊而生精液，使补而不滞；淫羊藿补肾温阳，取其阳中求阴之功，以增强补肾填精之效；炒知母泻火坚阴，制约淫羊藿温热之性；制香附、枳壳行气，益母草活血调经；党参健脾益气，补益气血生化之源，共为佐药。川牛膝活血通经，补肝肾，为使药。诸药合用，既能温补先天肾气以生精，又能培补后天脾胃以生血，使精血充足，天癸得养，胎孕可成。

研究显示，在早期卵泡闭锁过程中，卵母细胞首先发生凋亡；而在生长晚期的卵泡，颗粒细胞首先凋亡，诱导卵母细胞凋亡，触发卵泡闭锁。当大量卵泡以高于生理代谢速度闭锁时，才可能发生POI，卵巢颗粒细胞的异常凋亡也因此成为POI发病的始动因素。谢敏等［9］在卵泡超微化结构的研究中发现，闭锁卵泡中存在一系列凋亡形态的改变（包括核固缩、胞质出现空泡、形成凋亡小体等），而这些变化最先发生在颗粒细胞中。本研究通过流式细胞定量检测发现，POI 大鼠卵巢颗粒凋亡率明显增高；经不同剂量的补肾养精颗粒干预后，均可以降低颗粒细胞晚期凋亡的发生率，而高剂量补肾养精粒还可以降低颗粒细胞早期凋亡的发生率，抑制染色体DNA 发生断裂。透射电镜下观察POI大鼠卵泡超微化结构异常，而中药中、高剂量组卵母细胞及颗粒细胞形态接近空白组，细胞器数量增多，细胞器结构改善或恢复正常，表明补肾养精颗粒可以改善卵泡超微化结构。

闭锁卵泡的颗粒细胞死亡可能由几个凋亡相关基因的蛋白质产物控制，Bcl-2家族中的多个成员在大鼠卵巢颗粒细胞中表达，通过拮抗卵泡膜细胞和颗粒细胞的凋亡，抑制卵母细胞凋亡，减少卵泡闭锁，而Bax 通过拮抗Bcl-2 对细胞的保护作用而促进细胞凋亡［10］。本研究结果显示，给予雷公藤多苷后，模型对照组大鼠卵巢颗粒细胞激活了促凋亡基因Bax，抑制抑凋亡基因Bcl-2表达；不同剂量的补肾养精颗粒均可下调Bax 蛋白表达、上调Bcl-2 蛋白表达，并且颗粒细胞凋亡率与凋亡基因的表达水平相一致，Bax 表达降低，Bcl-2 表达升高，则颗粒细胞凋亡率减少；反之，颗粒细胞凋亡率增多。这表明补肾养精颗粒可以通过下调Bax 表达、上调Bcl-2 表达，抑制颗粒细胞凋亡。

Hh 信号通路是一条参与生物细胞胚胎生长发育的重要通路，存在于哺乳动物的卵泡颗粒细胞和卵泡膜细胞中，它通过调节重要细胞因子和功能蛋白的表达，参与转录调节、迁移、增殖、基因表达、存活和凋亡等多种细胞的生物学行为［11］。在哺乳动物体内 Hh 蛋白家族主要包括 Ihh、Shh 及 Dhh3 种同源蛋白。Hh 信号通路的传递受靶细胞上蛋白受体复合物的调控，即Ptch 和Smo。哺乳动物的Ptch 基因有两个同源蛋白，即 Ptch1 和 Ptch2，Ptch1 与 Hh 配体结合后可以激活经典的Hh信号通路［12］。Gli基因是Hh 信号通路的转录因子，有三种蛋白亚型，分别是Gli1、Gli2 和 Gli3，其中，Gli1 是 Hh 信号通路的阳性转录因子，有较强的转录激活作用，是Hh 信号通路的靶基因［13］。Shh 信号通路是目前研究最成熟，也是在体内分布较为广泛的一个信号通路，与卵巢颗粒细胞凋亡关系密切。当Shh蛋白与Ptch1结合后，解除了Ptch 对Smo 的抑制，Smo 可以引起下游阳性转录因子Gli1释放并活化进入细胞核内，启动Hh靶基因的转录和表达。Shh 信号通路在激活Gli 基因家族后，可以调控包括Bax、Bcl-2等靶基因的表达抑制卵巢颗粒细胞的凋亡［14-15］。本研究结果显示正常生育期大鼠卵巢组织中有一定的Hh 信号活性，POI模型大鼠卵巢组织中Hh 信号通路的关键基因表达均明显降低，不同剂量的补肾养精颗粒干预后各组卵巢Shh、Ptch1、Gli1 蛋白表达均显著升高，表明补肾养精颗粒可以激活Hh信号通路的表达，从而促进颗粒细胞的增值，抑制颗粒细胞凋亡。

综上所述，补肾养精颗粒可明显抑制POI 模型大鼠的卵巢颗粒细胞凋亡，其机制可能与激活Hh信号通路，同时下调促凋亡基因Bax 表达、上调抑凋亡基因Bcl-2 表达有关。我们的研究为POI 发病机制以及治疗提供新思路和新靶点，但Hh信号通路及其调节机制与POI 的关系还处于起步阶段，仍需进一步深入研究。