EK-PRB 联合酵母菌对镉污染土壤修复研究

李 昕，周海东，徐昕璇，叶宓煊

（上海理工大学 环境与建筑学院，上海 200093）

土壤环境是自然环境的组成部分，是地球生物体赖以生存的基础。近年来，快速发展的工业、现代农业以及丰富的人类活动，使得我国土壤环境遭到巨大影响，污染面积不断扩大，土壤质量恶化严重。土壤重金属污染已成为严重的环境问题，世界范围内都受到影响[1]。土壤重金属污染来源广泛，包括采矿、化工、冶炼业排放废物，矿产资源开发，化肥的过度使用和污水灌溉等[2]。土壤污染种类多样，其中土壤重金属镉（Cd）污染严重，2014 年，全国土壤污染状况调查公报中指出，Cd 点位超标率已达到7.0%[3]。因此，本文针对Cd 污染土壤的修复技术进行研究，探求有效的修复方法，以降低土壤中Cd 污染造成的环境风险，具有一定的现实意义。

1 土壤Cd 污染及研究现状

重金属Cd 不是人体必需的元素，其化学活性强，生物毒性强且持久，极易通过食物链在人体内富集，危及人类健康，对人身体产生致病、致癌和致突变作用。重金属Cd 污染来源主要有两个途径：一个是自然来源，自然条件下，含Cd 的岩石矿物在长期的风化作用下，释放在土壤中，构成土壤中Cd背景值[4]；另一个是人为来源，工业废气及废物、化肥使用、含Cd 废水灌溉都会造成土壤Cd 污染[5-6]。张倩等[7]以贵州普定喀斯特关键带作为研究区域，对土壤中的Cd，Cu 等5 种重金属进行分析，结果发现，Cd 和Mn 有效态成分占比高，Cd 对耕地构成高生态风险。

重金属污染土壤治理技术多样，包括钝化修复技术、电动修复技术、土壤淋洗技术、微生物修复技术、植物修复技术等[8-12]。由于单一修复技术受限大，通常修复效率偏低，植物修复耗时较长，因此，研究污染土壤联合修复技术，提升重金属污染土壤修复效果是趋势所在。微生物修复技术具有修复成本较低，无二次污染的优势。固定化微生物技术[13-15]属于微生物修复，具有成本低、效果好、可重复利用、利于固液分离等优点。固定化微生物制备方法多种多样，大致可以分成吸附法、包埋法、共价结合法和交联法等[16]。戚鑫等[17]研究发现，以生物炭为载体材料，吸附固定化微生物对于修复重金属污染土壤效果较好。固定化酵母菌与酵母菌相比，Cd2+吸附率可提高6%～8%，能够有效提高Cd2+去除率[18]。

电动-可渗透反应墙（EK-PRB）技术[19-21]通过电场作用使毒性较高的重金属向电极两端迁移，当重金属离子在电渗流、电迁移作用下迁移至阴极附近的可渗透反应墙（PRB）时，通过被PRB材料吸附、降解或者形成沉淀等方式，达到去除或降低污染程度的目的。PRB 材料的选择对于重金属污染土壤修复至关重要，修复周期和效果与PRB 材料相关联[22]。Zhou 等[20]以沸石+粉煤灰组合为PRB 材料，以柠檬酸为电解液，对Pb 污染高岭土进行修复，去除率最高达到了80.7%。Xu 等[23]研究发现，使用EDTA 电解液对污染土壤进行预处理，可有效提高EK-PRB 对于As 和Cr 的去除率。

固定化微生物技术在污染水体治理中应用广泛，在土壤重金属污染修复方面需进一步研究。EK-PRB 技术中PRB 材料的选择至关重要，现有研究大多是采用粉末状的材料，在清理和回收方面存在一些问题。另外，单一的PRB 材料对于土壤中重金属的去除可能没有达到较佳效果。目前，固定化微生物联合EK-PRB 技术的应用研究较少，将这两种技术进行联合，提高重金属污染修复效果，是具有一定价值的研究方向。本研究在EK-PRB 修复重金属污染土壤基础上，联合固定化微生物技术，制备出粉煤灰-酵母菌小球作为PRB 材料，探究在不同的电压梯度下，对于Cd 污染实际土壤的修复效果，探究固定化微生物联合EK-PRB 技术修复Cd 污染土壤的应用可能性。

2 材料和方法

2.1 试剂和材料

试验所用土壤来自于上海理工大学花坛土表层土壤。土壤的pH 值为6.85，电导率为572 μm/cm，有机质含量为8.31%，Cd 浓度为0.34 mg/kg，Pb浓度为14.78 mg/kg，Cu 浓度为13.48 mg/kg，Fe浓度为6 183.78 mg/kg，Mn 浓度为236.73 mg/kg。为了减少受试土壤产生的误差，试验前，采集10 kg土壤，放在避光、封闭的条件下保存，去除土壤中的石块、植物，在105 ℃条件下烘50 h，研磨过1.00 mm 筛网。

试验所使用的粉煤灰是工业副产品，来自河南省巩义市豫联电厂，粒径2～45 μm，酵母菌来自高活性干酵母，购买于安琪酵母股份有限公司。硝酸镉四水Cd(NO3)2·4H2O、一水合柠檬酸（CA）和乙二胺四乙酸二钠（EDTA）均为分析纯，土壤消解所用试剂盐酸（HCl）、硝酸（HNO3）、氢氟酸（HF）、高氯酸（HClO4）均为优级纯，均购买自国药集团化学试剂有限公司。

污染土壤制备：设定Cd 污染浓度为200 mg/kg，含水率调整为30%；称取500 g 烘干过1.00 mm 筛网的土壤，Cd(NO3)2·4H2O 分子量为308.47，其中Cd2+所占比例为36.44%，则每组试验需要的Cd(NO3)2·4H2O 质量为274.4 mg，溶解0.274 4 g Cd(NO3)2·4H2O 于150 mL 纯水中，均匀混入500 g土壤中，得到Cd 污染试验土壤。

粉煤灰-酵母菌小球制备：称取定量高活性干酵母粉加入2%灭菌葡萄糖溶液中活化，得到种子液后加入灭菌YPD 培养基中，放置在恒温培养摇床中，在200 r/min，26 ℃条件下进行培养，经离心机离心（5 500 r/min）5 min 后，收集酵母菌菌体，用纯水清洗3 次后，添加纯水制成菌悬液。将粉煤灰与菌悬液混匀，放置于摇床中，避光培养3 h（200 r/min），使酵母菌充分吸附在载体材料上，得到酵母菌-粉煤灰溶液。配制海藻酸钠（SA）溶液并与酵母菌-粉煤灰溶液混合均匀，得到酵母菌-粉煤灰-SA 溶液，用注射器滴加酵母菌-粉煤灰-SA 溶液到4%氯化钙（CaCl2）交联溶液中，交联8 h 得到粉煤灰-酵母菌小球，如图1 所示，在室温（26 ℃）条件下干燥至恒重。

图1 粉煤灰-酵母菌小球示意图Fig.1 Schematic diagram of fly ash-yeast pellets

2.2 试验装置

本试验采用的装置如图2 所示。实际电动土壤修复工程中，修复范围大，单对板状电极修复效果不太理想。该装置采用柱状电极，模拟实际应用中的非均匀电场，增加PRB 室，提高土壤修复效果。装置构成有阴极室（10 mm×120 mm），PRB 室（环形，（10～30）mm×120 mm），土壤室（环形，（30～70）mm×120 mm），以及6 个阳极室（30 mm×30 mm×120 mm），电极排布方式按照阵列式，装置材质为有机玻璃，由上海成珊仪器仪表有限公司生产制造。

图2 试验装置示意图Fig.2 Schematic diagram of experimental device

试验采用直流稳压电源，规格为0～60 V，5 A，东莞市同门电子科技有限公司生产；电极棒采用高纯石墨电极，购自内蒙古万兴碳素有限公司。

2.3 试验方法

PRB 水体吸附试验：准备2 组200 mg/L Cd(NO3)2·4H2O 溶液各100 mL，一组投加2 g 粉煤灰-酵母菌小球，一组投加2 g 粉煤灰，搅拌后放入摇床，设置转速为200 r/min，温度26 ℃，振荡24 h 后测定溶液中Cd 浓度，计算单位质量粉煤灰-酵母菌小球、粉煤灰对Cd 的吸附量。

土壤修复试验：将制备的500 g 污染土壤均匀放置于试验装置土壤室中，PRB 室中加入PRB 材料（粉煤灰–酵母菌小球、粉煤灰），阴极室和阳极室中分别加入15 mL 的0.1 M CA+0.01 M EDTA 电解液，静置平衡24 h。通电后每24 h 更换阴阳极电解液，设置不同的电压梯度，探究不同电压梯度下，PRB 为粉煤灰-酵母菌小球对于Cd 污染土壤的修复效果。设置6 种电压梯度，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，2.5 V/cm，得到合适的电压梯度后，增设PRB 材料为粉煤灰的试验，试验方案如表1 所示。结束5 d 修复周期后，分别在距离阳极4 mm（S1），12 mm（S2），20 mm（S3），28 mm（S4），36 mm（S5）处进行取样，用于测定修复后土壤中Cd 浓度，分析去除效果。

表1 土壤修复试验方案Tab.1 Experiment program of soil remediation

2.4 分析方法

首先，计算各取样点Cd 去除率。将修复后各取样点土样均进行105 ℃干燥处理，干燥后研磨过孔径74 μm 筛网，分别称取0.200 0 g（±0.0001 g），经过HCl-HNO3-HF-HClO4消解后，用5%稀硝酸定容至10 mL，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，使用Optima8000 型ICP-OES 电感耦合等离子体发射光谱仪测定水样及土样中Cd 浓度。水体吸附试验PRB 单位质量吸附量及土壤修复试验Cd 去除率如下式所示：

式中：Sw为PRB 单位质量吸附量，mg/g；C0为水体实测初始Cd 浓度，mg/L；Cw为吸附后Cd 浓度，mg/L；ηs为Cd 去除率，%；Ci为修复前土壤初始Cd 浓度，mg/kg；Cf为修复后土壤Cd 浓度，mg/kg。

然后，记录稳压电源显示的电流变化情况，测定修复试验后各土样的pH、电导率。土样与纯水按照1∶2.5 的比例混匀，在摇床中振荡30 min后离心，采用梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司FE20 型实验室pH 计测定上清液pH；土样与纯水按照质量（g）和体积(mL)比1∶5 的比例混匀，置于漩涡混合仪5 min 后离心，采用梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司FiveEasy 型电导率仪测定上清液电导率。

3 结果与讨论

3.1 PRB 水体吸附效果

粉煤灰-酵母菌小球和粉煤灰吸附水体中Cd的效果如表2 所示，由表中数据可以看出，在水体吸附试验中，利用固定化微生物技术制成的粉煤灰-酵母菌小球吸附效果优于单纯粉煤灰，粉煤灰-酵母菌小球对Cd 的单位质量吸附量接近5.0 mg/g，对于Cd 的去除有较大影响，是有研究价值的PRB材料。

表2 水体吸附试验效果Tab.2 Effect of water adsorption experiment

3.2 土壤修复试验电流变化

不同试验组别电流变化如图3 所示。分析图3中电流的变化，开始通电后，电流呈上升状态，到达最高值后开始下降，与Yu 等[24]研究中的电流变化现象相似。更换电解液后电流增加，每个电解液更换周期内，电流均呈现先上升后下降的变化现象。

图3 修复过程中电流变化情况Fig.3 Current changes during remediation

从图中可以看出，在1.0～5.0 V/cm 范围内，电压梯度越大，电流起始值与峰值越高，这是电压梯度对试验土壤中离子的迁移产生了影响。电流在最初通电后呈现上升趋势，这是由土壤中溶解的离子浓度升高、金属离子的持续释放造成的[25]。随着试验进行，每个电解液更换周期中电流的峰值降低，电流整体呈现下降趋势，这是由于“电阻极化”，阴极表面产生一层白色的物质，影响电导性，对电流产生了影响[26]。

3.3 土壤修复试验pH 变化

不同试验组别各取样点土壤pH 变化如图4 所示。土壤的pH 值与土壤的性质有关，原始土样pH 为6.85。修复后土壤pH 值从阳极到阴极（S1—S5）总体呈上升趋势，各组别S1 区域土壤pH 值较低，均在5.00 以下，S5 区域土壤pH 值均高于9，总体分布范围在3.00～11.50。其中，电压梯度为5.0 V/cm 时，靠近阴极S5 区域土壤pH 值达到11.43，这种现象主要是由于阴阳两极处水的电解，阳极处反应产生大量的H+，阴极处产生OH-[27]。试验采用阵列式电极，阴极与阳极个数比例为1∶6，对阴极S4，S5 区域pH 值有一定影响。

图4 修复后各取样点土壤pH 值Fig.4 Soil pH value of each sampling point after remediation

综合对比Test 1～6 试验，可以看出电压梯度对于各取样点土壤pH 变化影响不明显，这是由于电压梯度影响土壤中离子迁移，但不能决定土壤中H+和OH-的分布[28]。由Test 6 与Test 7 土壤pH变化情况可以看出，各取样点土壤pH 受PRB 材料的影响不显著。

3.4 土壤修复试验电导率变化

不同试验组别各取样点土壤电导率变化如图5 所示。土壤的电导率与土壤的性质有关，原始土样电导率为572 μm/cm。总体来看，修复后土壤电导率从阳极到阴极（S1—S5）总体呈先下降后微上升的趋势。各组别靠近阳极S1 区域土壤电导率高，均在1 200 μm/cm 以上。这是由于S1 区域pH值较低，离子在酸性条件下更容易释放。除Test 1和Test 2 外，其余试验组均表现为S4 区域土壤电导率最低，这与秦丰林等[29]修复Cd 污染土壤研究中增强组电导率变化相似。

图5 修复后各取样点土壤电导率Fig.5 Soil conductivity of each sampling point after remediation

综合对比Test 1～7 发现：Test 7 组土壤电导率较低，这可能是由于电解液中的离子迁移入土壤的过程受PRB 影响；Test 1～6 中，微生物的加入对电渗和电泳起到正向促进作用[30]。较高的电压梯度对土壤空隙中离子的迁移过程起促进作用[20]，因此，土壤电导率与电压梯度总体呈正相关性。

3.5 土壤修复试验Cd 去除率变化

3.5.1 不同组别各取样点Cd 去除率变化

不同试验组别各取样点土壤Cd 去除率变化如图6 所示。修复后由靠近阳极的S1 区域到靠近阴极的S5 区域，各取样点土壤Cd 去除率呈现先下降后上升的趋势。S1 区域Cd 去除率最高，均达到70%以上，S3，S4 区域Cd 去除率较低，这与Sun等[31]研究电动修复Cd 污染土壤后Cd 分布现象类似。S1 区域土壤Cd 去除率较高，是由于S1 靠近阳极，水分含量较高，pH 值较低，有利于各种离子包括Cd2+的移动。由图6 可发现电压梯度在3.0，4.0，5.0 V/cm 时，S3 区域Cd 去除率最低，电压梯度在1.0，2.0，2.5 V/cm 时，S4 区域Cd 去除率最低，部分组别出现负值，这种现象可能是由于电解液为CA 和EDTA，与土壤中Cd2+形成带负电的络合物[Cd-EDTA]m-，在电场的作用下向阳极方向迁移，进而在S3，S4 区域产生了重金属聚集[32]。

图6 修复后各取样点土壤Cd 去除率Fig.6 Cd removal rate of each sampling point after remediation

3.5.2 不同组别Cd 去除率

不同试验组别土壤Cd 去除率变化如图7 所示，综合对比Test 1～ 6 发现，随着电压梯度的增大，Cd 去除率也随之增加。在电压梯度由1.0 V/cm到3.0 V/cm 增加过程中，电压梯度对Cd 去除率影响显著，Cd 去除率增长20%以上。电压梯度由3.0 V/cm 增加到5.0 V/cm 时，Cd 去除率仅增加2.62%，当电压梯度为2.5 V/cm 时，相较于2.0 V/cm时Cd 去除率增加了6.14%，与3.0 V/cm 时相比Cd去除率相差很小。因此，考虑经济实用性，电压梯度2.5 V/cm 是最佳选择。对比Test 6 与Test 7 可以发现，相同电压梯度下，Test 6 中Cd 去除率高于Test 7，这说明当运用固定化微生物技术制备得到的粉煤灰–酵母菌小球作为PRB 材料时，Cd 污染土壤的修复效果更好。

图7 修复后各组别土壤Cd 去除率Fig.7 Cd removal rate of each test after remediation

在以往的Cd 污染土壤修复研究中，尹静玄等[30]对比传统的电动修复后得出，运用耐镉细菌联合电动技术，Cd 去除率会增加，在电压梯度为1.0 V/cm的条件下，总Cd 去除率最佳可达到30.77%。本研究在EK-PRB 技术的基础上联合固定化微生物技术对Cd 污染土壤进行修复，对比单一粉煤灰作为PRB 修复Cd 污染土壤，修复效果有明显提升，体现了固定化微生物联合EK-PRB的可行性以及修复优势。

4 结论

利用固定化微生物技术制备粉煤灰–酵母菌小球，进行水体吸附试验，对比粉煤灰–酵母菌小球和粉煤灰对Cd 的去除效果。进而联合EK-PRB 技术，对Cd 污染土壤进行修复，探究电压梯度、PRB材料对于修复过程中土壤电流、修复后土壤pH 及电导率、Cd 去除率的影响。结论如下：

a.粉煤灰–酵母菌小球相较于粉煤灰，对Cd 具有更高的单位质量吸附量，7 组土壤修复试验中，Cd 去除率最高达到56.9%，固定化微生物联合EK-PRB 技术对于Cd 污染土壤修复效果较好。

b.电流起始值与峰值与电压梯度成正比，在更换电解液周期里呈现先增加后下降现象；修复后土壤pH 值由阳极区域到阴极区域逐渐升高，总体在3.0～11.5 之间，电压梯度对于土壤电导率的变化影响较大。

c.随着电压梯度的增加，Cd 污染土壤修复效果有所提升，但在2.5～5.0 V/cm 范围内，增长幅度不大，考虑用电造成的电能消耗以及污染土壤的修复效果，电压梯度2.5 V/cm、PRB 材料为粉煤灰–酵母菌小球时为最佳选择。后续可针对修复前后的土壤重金属进行形态分析，研究重金属的形态分布情况，进一步探究固定化微生物联合EKPRB 技术修复机理。