4 种秋海棠花香挥发性物质测定与特征香气成分分析

杜文文，段 青，贾文杰，马璐琳，王祥宁，王继华

(云南省农业科学院 花卉研究所，国家观赏园艺工程技术研究中心，云南 昆明 650205)

花香是观赏植物重要的商品性状之一，被誉为“花卉的灵魂”[1].在很长一段时间内，花卉育种方向大多集中在花型、花色、花期、抗性等方面，忽略了花香[2-3]，使得很多植物花朵香气成分消失或浓度降低[4].调查发现，花香比花色和花型更能影响消费者的决定[5-6]，不仅如此，花香香气成分在农业、生物学、医药和香水化妆品工业等方面还具有重要价值[7].因此，近年来花香成为热门研究领域之一[8-9].

秋海棠（Begonia）花色鲜艳，叶色丰富，观赏价值高，野生种类超过2 000 个[10]，园艺品种多达15 000个[11]，是世界上种植范围最广的花坛和室内装饰花卉之一.目前秋海棠育种目标主要集中在花型、花色、叶型、叶色等方面，针对花香育种研究尚未见报道.笔者在资源收集评价过程中，发现假厚叶秋海棠（B.pseudodryadis）、中华秋海棠（B.grandis）、柳叶秋海棠（B.fuchsioides）和里氏秋海棠（B.listada）花朵均具有香味.本研究就以这4 个种类盛花期的花朵为材料，采用顶空固相微萃取（head space-solid-phasemicroextraction，HS-SPME）结合气相色谱−质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术检测它们的花香挥发性物质，鉴定各自种类的关键致香成分，比较不同种类间的成分差异，从而进一步了解秋海棠花香成分组成，为培育香味秋海棠品种提供理论指导，并为后续秋海棠花香成分代谢途径关键酶基因挖掘和分子育种提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 材料假厚叶秋海棠、中华秋海棠、柳叶秋海棠和里氏秋海棠均种植于云南省农业科学院花卉研究所球宿根花卉育种基地.4 个种类均为雌雄同株异花植物，嗅觉感官雌雄花香气相似，采集健康植株盛开期的雄花和雌花，假厚叶秋海棠和里氏秋海棠雌花数量少，仅采集了雄花进行测定，重复3 次.

1.2 仪器手动固相微萃取进样器（美国Supelco公司），75 μm CAR/PDMS 萃取头（美国Supelco 公司），7890B-5977A 气相色谱−质谱仪（GC-MS，美国Agilent 公司），50 mL 广口三角瓶，其中75 μm CAR/PDMS 萃取头主要用于痕量VOC 测定，已应用在食用玫瑰等植物香气测定上[12].

1.3 顶空固相微萃取顶空固相微萃取参照王珍珍等[12]的方法，先将萃取头插入GC-MS 进样口，250 ℃老化处理40 min，之后分别称取4 种秋海棠花朵约1 g，放入50 mL 广口三角瓶底部，以癸酸乙酯为内标，迅速将萃取头插入三角瓶中下部，室温下萃取30 min，由于瓶口较大，萃取头较小，插入前用几层纱布包裹进样器的可调针深度规部分，插入后用封口膜将瓶口密封，以防漏气.萃取完成后，取出SPME 萃取头，插入GC-MS 进样口，解析30 s后，进样分析.

1.4 GC-MS 分析气相色谱条件：色谱柱为HP-5MS 石英毛细管色谱柱(30 m×ϕ0.25 mm，0.25 μm)，99.99%的氦气作为运载气体，隔垫吹扫流量为3.00 mL·min−1；柱前压100 kPa；程序升温：起始温度 为40 ℃，以3 ℃·min−1升温至80 ℃，继续以5 ℃·min−1升温至250 ℃，最后在250 ℃保持5 min.质谱条件：采用EI 离子源，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，传输线温度250 ℃，电子能量70 eV，质子扫描范围为35～500，柱压100 kPa.

1.5 花香成分定性与定量分析挥发性物质成分经气相色谱分离，形成由各物质色谱峰组成的总离子流色谱图，总离子流图用MSD ChemStation Data Analysis F.01.03 软件打开，各组分通过自动积分并结合NIST14.L 谱库检索进行确定.根据挥发物与内标的峰面积比值计算出挥发物的相对质量分数.计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 4 种秋海棠花朵挥发性成分分类由于中华秋海棠和柳叶秋海棠雌雄花的花香成分和质量分数无显著差别，以4 种秋海棠雄花为材料进行统计，共检测出54 种挥发性成分，包括9 种烷烃类化合物、27 种萜烯类化合物、11 种苯类/苯丙素类化合物和7 种脂肪酸衍生物.柳叶秋海棠花朵挥发性成分最多，有28 种，其中烷烃类化合物5 种，占总质量分数的6.43%，萜烯类化合物10 种（单萜7 种，倍半萜3 种），占总质量分数的35.72%，同时检测到9 种苯类/苯丙素类化合物和4 种脂肪酸衍生物，分别占总质量分数的46.93%和10.92%.假厚叶秋海棠和中华秋海棠花朵挥发性成分略少于柳叶秋海棠，分别有23 种和21 种，假厚叶秋海棠中有3种烷烃类化合物，占总质量分数的14.58%，萜烯类化合物18 种（单萜5 种，倍半萜13 种），占总质量分数的75.44%，2 种苯类/苯丙素类化合物占总质量分数的9.98%，未检测到脂肪酸衍生物.中华秋海棠中烷烃类化合物有5 种，萜烯类化合物11 种（单萜5 种，倍半萜6 种），苯类/苯丙素类化合物3 种，脂肪酸衍生物2 种，分别占总质量分数的2.57%、78.61%、11.96%、6.85%.里氏秋海棠花朵挥发性成分最少，仅为15 种，其中烷烃类化合物6 种，萜烯类化合物5 种（单萜4 种，倍半萜1 种），苯类/苯丙素化合物和脂肪酸衍生物各有2 种，分别占总质量分数的16.90%、11.31%、49.63%、22.16%（图1）.从中可以看出假厚叶秋海棠和中华秋海棠花朵挥发性成分主要是萜烯类化合物，里氏秋海棠花朵挥发性成分主要是苯类/苯丙素类化合物，这两类化合物在柳叶秋海棠挥发物中的质量分数均较高.

图1 4 种秋海棠花朵不同类型挥发性化合物相对质量分数Fig.1 The relative mass fraction of different kinds of volatile compounds in four kind of Begonia species flowers

2.2 4 种秋海棠花朵挥发性成分质量分数分析各种类花朵挥发性成分总质量分数不同，柳叶秋海棠>中华秋海棠>假厚叶秋海棠>里氏秋海棠.其中柳叶秋海棠和中华秋海棠花朵挥发性成分总质量分数均在13 000 μg·kg−1以上，是假厚叶秋海棠的2 倍多，里氏秋海棠的5～6 倍.4 个种类共有的挥发性成分只包括十二烷、十三烷和芳樟醇等3 种物质，十二烷在假厚叶秋海棠和柳叶秋海棠中的质量分数较高，分别为535.46 μg·kg−1和715.40 μg·kg−1，在中华秋海棠和里氏秋海棠中的质量分数低于330 μg·kg−1，芳樟醇在中华秋海棠中的质量分数（1 125.58 μg·kg−1）较高，在其他3 个种类中的质量分数均低于350 μg·kg−1，十三烷在4 个种类中的质量分数均较低.假厚叶秋海棠花朵挥发性成分质量分数最高是β-石竹烯，为1 606.25 μg·kg−1，其他化合物的质量分数均低于1 000 μg·kg−1，反式氧化芳樟醇、Panaxene、Silphiperfol-5-ene、人参烯、Ginsinsene、α-菖蒲醇、蓝桉醇、人参新萜醇等化合物的质量分数不高，但均是假厚叶秋海棠花朵特有挥发性成分.中华秋海棠中质量分数比较高的成分有β-罗勒烯、α-法呢烯、苯乙腈、芳樟醇、别罗勒烯、2-乙基己醇乙酸酯等，其中苯乙腈、别罗勒烯、2-乙基己醇乙酸酯等化合物是其特有的挥发性成分.柳叶秋海棠中仅苯乙醇、β-月桂烯、D-柠檬烯、3-己醇的质量分数在1 500 μg·kg−1以上，其他化合物的质量分数均在几十到几百μg·kg−1不等.里氏秋海棠花朵中二丁基羟基甲苯、2-己酮、十二烷、对二甲苯、β-月桂烯等化合物的质量分数较高，其中二丁基羟基甲苯的质量分数为假厚叶秋海棠的近4 倍，中华秋海棠的约5 倍，对二甲苯的质量分数低于柳叶秋海棠和假厚叶秋海棠，β-月桂烯的含量仅为柳叶秋海棠的1/25，2-己酮是其特有挥发性成分（表1）.

表1 4 种秋海棠花朵主要挥发性成分质量分数Tab.1 The volatile component amounts of four kind of Begonia specie flowers

续表 1

续表 1

2.3 4 种秋海棠花朵特征香气分析以4 个种类花朵挥发性成分含量为基础，利用风味阈值法计算各种类的香气值（Odor activity value，OAV）.将香气值大于或等于1 的物质确定为秋海棠的特征香气成分，并对香味特征进行分类.从表2 可以看出，共鉴定出15 种特征香气成分，香气值最高的是中华秋海棠特有的成分β-罗勒烯，香气值为2 454.66；其次是柳叶秋海棠中的D-柠檬烯（226.32），为中华秋海棠的10 倍，假厚叶秋海棠的20 倍；芳樟醇、月桂烯、癸醛在不同种类中均具有较高的香气值，香气值范围在7.01～187.60 之间；β-石竹烯、α-法呢烯和苯乙醇的香气值在6～10 左右，分别为假厚叶秋海棠、中华秋海棠和柳叶秋海棠的特有成分；各种类其他特有成分除己酸甲酯、苯甲酸甲酯、十二醛的香气值大于2 以外，水杨酸甲酯、苯乙腈、天竺葵醛、茴香醛的香气值均在1.3～1.5 左右，15种特征香气成分可以分为甜香、果香、草香、花香、清香、脂肪味6 种香气类型.

表2 香气物质的风味阈值及4 个秋海棠种类花朵挥发性成分的香气值Tab.2 Flavor thresholds of aroma substrances and aroma values of volatile components of four kind of Begonia species

为直观展示4 种秋海棠花朵的香气特征，以0～各类香气的OAV 总和设定阈值绘制香气轮廓图（图2），展示每种香气类型的强弱.由图2 可知，不同种类具有不同的香气轮廓，其中果香、草香、甜香、花香是4 种秋海棠的主要特征香气，但浓郁程度及侧重香气各不相同，假厚叶秋海棠花朵更加突出果香气味，中华秋海棠花朵则更加突出草香气味，柳叶秋海棠花朵兼有果香、甜香气味，里氏秋海棠花朵则具有花香、果香和甜香气味，这与直接嗅闻4 种秋海棠花香的结果一致.

图2 4 个种类花朵香气特征雷达图Fig.2 The radar chart of volatile characteristic in four kind of Begonia species flowers

2.4 4 种秋海棠花朵主要香气物质主成分分析从特征香气成分中选取香气值在1 以上的14 个物质和释放量较高的4 个物质共18 种挥发性成分进行PCA 分析.由图3 可知，PC1 的贡献率为52.41%，PC2 的贡献率为32.17%，二者的累计贡献率为84.58%.4 个种类分布在4 个不同区域且距离较远，说明它们之间主要香气物质具有较大差异.假厚叶秋海棠位于PC1 负轴和PC2 负轴区域，主要香气物质有β-石竹烯、β-人参烯；中华秋海棠位于PC1负轴和PC2 正轴区域，主要香气物质有2-乙基己醇乙酸酯、α-法呢烯、β-罗勒烯、苯乙腈、己酸甲酯、芳樟醇；柳叶秋海棠位于PC1 正轴和PC2 正轴区域，主要香气物质有癸醛、天竺葵醛、苯乙醇、苯甲酸甲酯、β-月桂烯、茴香醛、D-柠檬烯；里氏秋海棠位于PC1 正轴和PC2 负轴区域，主要香气物质有二丁基羟基甲苯和十二醛.

图3 4 种秋海棠挥发性物质的主成分分析Fig.3 PCA analysis of volatiles in four kind of Begonia species

3 讨论

植物花香物质，是植物花朵释放的次生代谢产物，主要是由许多低相对分子质量易挥发的化合物混合而成.花香成分复杂，从90 个属991 种（变种）植物中鉴定出1 700 多种花香物质[16]，主要分为萜烯类、苯类/苯丙素类、脂肪酸衍生物、氨基酸衍生物以及一些少数种类的特殊化合物等[17-18]，其中萜烯类和苯环/苯丙素类化合物是主要成分，几乎存在于所有植物的花香成分中.兰花[19]、菊花[20]、桂花[21-22]的花香物质主要是萜烯类化合物，梅花[23]、矮牵牛[24]的主要是苯环/苯丙素类化合物，月季[25]、百合[26-29]的包括这两类化合物.本文测得假厚叶秋海棠和中华秋海棠花朵挥发性成分主要是萜烯类化合物，里氏秋海棠花朵挥发性成分主要是苯类/苯丙素类化合物，柳叶秋海棠中这两类化合物的含量均较高.不同物种或品种间花香挥发物成分不同，主要挥发性成分的含量也存在差异，牡丹品种‘赵粉’中α-蒎烯的含量最高[30]，‘藏枝红’和‘红珠女’中含量最高的是苯乙醇，‘墨楼争辉’和‘李园红’中含量最高的是乙酸橙花酯[31].假厚叶秋海棠、中华秋海棠、柳叶秋海棠和里氏秋海棠中含量最高的分别是β-石竹烯、β-罗勒烯、苯乙醇和二丁基羟基甲苯.

特征香气成分对植物香味品质起决定性作用，最常用的鉴定方法是风味阈值法，目前该方法主要应用在食用产品（水果、茶叶、调料等）香气分析方面，植物花香分析中也有应用，切花菊品种‘神马’的特征香气成分有异环柠檬醛、桉叶醇、α-蒎烯、β-金合欢烯和石竹烯[32].桉树脑、β-月桂烯、β-罗勒烯是云锦杜鹃的特征香气成分[33]，本研究共鉴定出β-月桂烯、D-柠檬烯、β-罗勒烯、芳樟醇、天竺葵醛、癸醛、β-石竹烯、α-法呢烯、苯甲酸甲酯、苯乙醇、苯乙腈、水杨酸甲酯、茴香醛、己酸甲酯、十二醛共15 种特征香气成分.选取其中的14 个特征香气成分和4 个含量较高的成分进行 PCA 分析，发现PCA 模型中4 个品种能依据特征香气成分被显著区分，进一步证明鉴定出的香气物质在秋海棠香气品质构成中十分重要，是秋海棠的特征香气成分.