恩格列净上调沉默信息调节因子1减轻心肌缺血再灌流损伤

张 帆，陈 丽，曹旭东，赵春辉，陈小林

作者单位：南方科技大学医院心内科，深圳 518055

缺血性心脏病是世界范围内严重危害人类健康的重要原因，再灌注治疗是挽救缺血心肌的关键[1]，然而再灌注损伤的存在极大限制了治疗效果，因此探讨心肌缺血再灌流(myocardial ischemia reperfusion, MI/R)损伤的发病机制，寻找有效的治疗方法一直是基础和临床研究的热点和难点。Sirtuins是一类高度保守的组蛋白去乙酰化酶家族，其中沉默信息调节因子1(silent information regulator,SIRT1)在心血管系统中研究最为广泛[2]，在应激下调控心肌细胞的存活和生长；此外，SIRT1在缺血再灌流损伤中保护心肌细胞免受氧化应激和细胞凋亡的影响[3]。

钠-葡萄糖协同转运蛋白2(sodium-glucose cotransporter 2, SGLT2)抑制剂如恩格列净(empagliflozin, EMPA)是一类新型的降糖物，选择性抑制肾近端小管SGLT2对葡萄糖的重吸收，降低血糖[4]。EMPA还表现出了不依赖降糖的心血管保护功能，包括降低血压、血脂和尿酸，控制体质量和改善肾功能损伤等[5]。EMPA-REG OUTCOME试验首次证实了EMPA具有心血管保护作用[6]。因此，该研究拟采用离体心脏MI/R模型，探讨EMPA通过激活SIRT1信号改善非糖尿病大鼠MI/R中氧化应激和细胞凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与动物EMPA和氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)购自美国Sigma公司；丙二醛(malonaldehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和琥珀酸脱氢酶(succinodehydrogenase,SDH)含量和活性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；EX527购自美国Sigma公司，先用DMSO溶解后再用灌流液稀释；Cytochrome c、Cleaved caspase-3、SOD2、gp91phox和SIRT1抗体购自美国Cell Siginal Technology公司；GAPDH、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司；40只8周龄雄性SD大鼠购自南方科技大学实验动物中心，体质量约220 g，实验动物生产使用许可证：SYXK(粤)2017-0170，实验动物在标准环境下饲养，自由饮水、饮食，所有动物操作经南方科技大学实验动物伦理委员会同意，并严格按照标准实施。

1.2 Langendorff离体心脏灌流和实验分组采用以往离体心脏灌流的方法[7]，简述如下：2%异氟烷吸入式麻醉大鼠，固定在恒温手术台，快速暴露心脏并游离，将心脏固定在Langendorff主动脉逆行灌流管口，用Krebs-Henseleit(KH)液灌流20 min，KH液包含：118 mmol/L NaCl、25 mmol/L NaHCO3、4.75 mmol/L KCl、0.94 mmol/L KH2PO4、1.2 mmol/L MgSO4、1.4 mmol/L CaCl2、7 mmol/L Glucose、0.4 mmol/L oleate、1% 牛血清白蛋白、10 mU/ml 胰岛素，维持37 ℃，pH 7.4；将含有液体的球囊插入左室，连接Chart 8数据采集系统，监测左室压力变化，调节球囊内液体使各组初始左室舒张末压为0.67 kPa。实验随机分为：对照组(Control)、心肌缺血再灌流组(MI/R)、EMPA联合MI/R组(EMPA+MI/R)以及EMPA和EX527联合MI/R组(EMPA+EX527+MI/R)；心脏缺血40 min，再灌流2 h，EMPA+MI/R组再灌流开始前给予2.5 mol/L EMPA处理10 min，EMPA+EX527+MI/R组再灌流开始前先给予10 mol/L EX527处理5 min，再给予2.5 mol/L EMPA处理10 min。根据以往文献报道[7]确定EMPA的浓度。

1.3 心肌梗死面积的测量实验结束后，快速用干冰将心脏冰冻，沿心脏纵轴将心脏切成约2 mm薄片，将中间的一片放入1% TTC溶液中37 ℃避光水浴15 min，再放入4%多聚甲醛中固定2 d，拍照后用Image J软件测量面积，心肌梗死面积比例=白色区面积/总面积100%。

1.4 心脏功能的记录利用Chart 8数据采集系统(AdInstruments)记录左室压力(Left ventricular pressure,LVP)、左室收缩峰压(Left ventricular systolic peak pressure,LVSP)和左室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)的变化，比较各组LVSP和LVEDP数值的变化。

1.5 HE染色再灌流结束后，取下心脏并浸泡在4%多聚甲醛中固定2 d，再采用脱水复蜡将各组心脏包埋制备成蜡块切片，常规HE染色，并在镜下拍照观察。

1.6 ELISA检测按照MDA、SOD和SDH试剂盒说明书的步骤，提取心肌组织样品，配制工作液和标准品，并测定样品浓度，根据标准曲线计算各组心肌组织中MDA含量，SOD和SDH活性。

1.7 DHE染色再灌注结束后，立即用OCT包埋剂将心脏包埋并切成薄片；用浓度为10 μmol/L的DHE染液按照说明书步骤在37 ℃水浴避光孵育1 h，利用激光共聚焦显微镜观察并保存各组ROS图像。

1.8 Western blot检测蛋白表达称量左室前壁部位心肌组织，加RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂在冰上研磨裂解30 min，低温高速离心机26 000 r/min 4 ℃离心20 min，弃沉淀，上清液中加入上样缓冲液，金属浴煮10 min，分装并冻存于-80 ℃冰箱；经过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，低温湿转，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，切膜并放入相应一抗Cytochrome c、Cleaved caspase-3、SOD2、gp91phox、SIRT1和GAPDH中4 ℃过夜；TBST洗膜6次，每次5 min，用相应HRP标记的二抗室温孵育2 h，TBST洗膜6次，每次5 min，ECL化学发光，Image J图像分析软件分析条带灰度，GAPDH作为内参对照。

1.9 统计学处理统计数据采用表示，并用GraphPad Prism 8.0统计软件进行分析。各组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心脏结构和功能的比较如图1，Control组大鼠心肌纤维排列有序，心脏LVSP和LVEDP正常；MI/R组大鼠心肌纤维出现断裂，LVSP降低，LVEDP升高，与Control组比较，差异有统计学意义(F=134.7，P<0.001)；EMPA+MI/R组能改善心肌纤维排列，减轻断裂，LVSP增加，LVEDP降低，和MI/R组比较，差异有统计学意义(F=106.3，P<0.001)；而使用SIRT1抑制剂EX527后，能逆转EMPA对心脏结构和功能的保护作用，心肌纤维出现断裂，LVSP降低，LVEDP升高，和EMPA+MI/R组比较，差异有统计学意义(F=142，P<0.001)。

2.2 各组大鼠心肌梗死面积和细胞凋亡的比较如图2，TTC染色和Western blot结果表明：Control组心肌组织梗死面积为(0.87±0.62)%，凋亡蛋白Cleaved caspase-3和Cytochrome c蛋白表达量低；与Control组比较，MI/R组心肌梗死面积为(33.2±6.90)%，Cleaved caspase-3和Cytochrome c蛋白表达增加(F=116，P<0.001)；与MI/R组比较，EMPA+MI/R组心肌梗死面积为(10.1±7.24)%，Cleaved caspase-3和Cytochrome c蛋白表达降低(F=91.6，P<0.001)。与EMPA+MI/R组比较，EMPA+EX527+MI/R组心肌梗死面积为(32.8±7.06)%，Cleaved caspase-3和Cytochrome c蛋白表达量增加(F=99.8，P<0.001)。

2.3 各组大鼠心肌SIRT1、gp91phox和SOD2蛋白表达的比较如图3，Western blot结果表明：和Control组比较，MI/R组心肌组织中SIRT1和SOD2蛋白表达降低，gp91phox蛋白表达增加(P<0.01)；和MI/R组比较，EMPA+MI/R组心肌组织中SIRT1和SOD2蛋白表达增加，gp91phox蛋白表达降低(P<0.01)；而和EMPA+MI/R组比较，EMPA+EX527+MI/R组心肌组织中SIRT1和SOD2蛋白表达降低，gp91phox蛋白表达增加(P<0.01)。

图1 各组间心脏结构和功能的比较

图2 各组间心肌梗死面积和细胞凋亡的比较

图3 各组心肌SIRT1、gp91phox和SOD2蛋白表达的比较

图4 各组心肌氧化应激损伤的比较

2.4 各组大鼠心肌氧化应激损伤指标的比较如图4，DHE染色和ELISA结果表明：和Control组比较，MI/R组ROS表达和MDA含量增加，SOD和SDH活性降低，差异有统计学意义(F=64.2，P<0.001)；和MI/R组比较，EMPA+MI/R组ROS表达和MDA含量降低，SOD和SDH活性增加，差异有统计学意义(F=57.5，P<0.001)；和EMPA+MI/R组比较，EMPA+EX527+MI/R组ROS表达和MDA含量增加，SOD和SDH活性降低，差异有统计学意义(F=72.7，P<0.001)。

3 讨论

尽管在药物和手术治疗方面均取得了巨大进步，缺血性心脏病仍然是全世界范围内导致死亡的重要原因[8]。冠状动脉持续的缺血或缺氧会导致不可逆的心肌坏死，并可能伴有心律失常、休克或心力衰竭等严重事件[9]。随着再灌流治疗的发展，急性心肌梗死患者缺血引起的心肌损伤已明显减轻，然而，再灌流引起的心肌损伤却越来越明显，这也成为了严重限制再灌流治疗效果的瓶颈因素。本研究探讨了SGLT2抑制剂EMPA在大鼠离体心脏缺血再灌流模型中的保护作用和机制，为EMPA在心血管疾病中的应用提供了新的依据。

研究[5-6]表明，SGLT2抑制剂具有良好的心血管保护作用。而EMPA在糖尿病心肌损伤尤其是糖尿病MI/R损伤中具有明确的保护作用，EMPA能减小糖尿病小鼠MI/R后心肌梗死面积，改善左室舒张功能[10]。另外，EMPA还能改善肥胖和糖尿病小鼠心肌纤维化，降低心肌氧化应激和细胞凋亡[11]。然而，EMPA在非糖尿病MI/R中的作用尚不清楚。本研究显示，EMPA能够减轻非糖尿病大鼠离体心脏缺血再灌流后心肌纤维断裂，改善心脏功能，抑制细胞凋亡，这些结果证明了EMPA在非糖尿病大鼠MI/R中的保护作用。另外，SIRT1抑制剂EX527能够逆转EMPA的这些保护作用，这说明SIRT1参与EMPA的MI/R保护作用。

线粒体结构和功能损伤是心血管疾病发生发展的重要病理基础。在心肌缺血再灌流损伤中，ROS导致的线粒体氧化应激促进了心肌细胞凋亡并加重心肌氧化应激损伤[12]。细胞内ROS的主要来源是NADPH氧化酶家族，而其中gp91phox亚型在心肌病理性重塑中发挥重要作用[13]。SIRT1在心肌缺血再灌流中发挥重要的抗氧化和抗凋亡作用，增加SIRT1表达和去乙酰化酶活性可以抑制ROS累积和MDA含量并上调抗氧化酶如SOD和SDH活性[14]；同时，SIRT1抑制凋亡蛋白Caspase-3激活和Bax的表达，增加抗凋亡蛋白Bcl2的表达[15]。本研究显示，MI/R后心肌线粒体氧化应激损伤增加，表现为ROS和MDA含量以及gp91phox表达增加，SOD和SDH活性降低；而EMPA能明显降低MI/R中ROS和MDA含量以及gp91phox表达，增加SOD和SDH活性；而应用EX527后能逆转EMPA抗氧化应激损伤的作用。与此同时，EMPA能够上调MI/R处理后SIRT1的表达，而EX527可以阻断EMPA的这一作用，这些结果都表明SIRT1参与EMPA抗MI/R氧化应激损伤的作用。

综上所述，本研究首次在非糖尿病大鼠心脏缺血再灌流损伤中证实，EMPA具有通过减轻心肌细胞凋亡和线粒体氧化应激水平改善大鼠心脏损伤的作用，而这一作用与调控SIRT1信号通路有关。本实验结果为EMPA在非糖尿病心血管疾病中发挥保护作用提供了实验证据，也为EMPA在临床治疗心血管疾病的应用提供了依据。