IGF-1和IGF-2在成年牦牛皮肤毛囊生长周期中的表达与定位

2022-09-21魏鹏强余四九李仕杰牛静勇

核农学报 2022年10期

魏鹏强崔燕,2,* 余四九,2 李仕杰牛静勇张虔

(1 甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070；2 甘肃省牛羊胚胎工程研究中心，甘肃兰州 730070；3 天祝县动物疫病预防控制中心，甘肃天祝 733200)

牦牛(Bosgrunniens)是我国青藏高原特有的珍稀牛种之一，对促进牧民经济和文化繁荣发挥着重要的作用。牦牛长期生活在海拔3 000 m以上高寒、低氧、紫外辐射强的严酷环境中[1]。皮肤作为机体与外界环境接触的第一道屏障，具有阻断外来物质入侵、防止理化损伤、感受外界刺激、分泌活性物质以及调节体温等重要生理功能[2]。毛囊是哺乳动物皮肤的附属结构之一，由神经外胚层和中胚层发育形成，外胚层毛囊干细胞形成毛囊的所有上皮成分，而中胚层细胞将发育成毛囊真皮乳头和结缔组织鞘[3-4]。哺乳动物出生后，毛囊具有终生呈周期性生长的特性，即经历活跃的毛囊生长期、凋亡介导的退行期和相对静止的休止期[5]。毛囊干细胞、毛乳头细胞、毛母质细胞及脂肪细胞等均参与了毛囊的周期性生长[6]。毛囊贯穿于哺乳动物皮肤的表皮和真皮，其中毛囊干细胞位于毛囊壁及毛囊隆突部，而毛乳头细胞位于皮肤真皮，表皮部位的毛囊干细胞与真皮部位的毛乳头细胞之间信号交流是启动毛囊再生的关键[7]。相关文献报道，胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors,IGFs)是该信号传导的重要分子之一，对调节皮肤发育和毛囊周期平衡非常重要[8]。同时，IGFs作为低氧靶基因，在正常条件下可促进细胞分化，在缺氧条件下可刺激增殖[9-10]。牦牛世代生活在高寒低氧环境下，可作为研究IGFs促进细胞增殖的重要模式动物[11]。

胰岛素样生长因子包含2个配体，分别是胰岛素样生长因子1(IGF-1)和胰岛素样生长因子2(IGF-2)，以及2个受体(IGF1R和 IGF2R)，6个高亲和力结合蛋白(IGFBP1～6)[10]。研究发现，IGF-1是调节毛囊有丝分裂和生长分化的重要因子，其信号转导通路具有影响毛囊增殖、组织重塑、毛发生长周期转换和毛囊分化的作用[12]。体外试验表明，外源性IGF-1可以显著促进体外培养的毛囊生长,影响毛囊的形态发育[13-15]。IGF-2是胚胎期的重要调节因子，在细胞的增殖、分化，程序性细胞死亡和转化过程中发挥着重要作用[16]。毛囊一般在晚期胚胎发生时被诱导形成[17]。最新研究证明，羔羊的皮毛主要在胚胎期发育，从95 d胎龄到出生前几天是初级毛囊和次级毛囊高度发育的时期[18]。而之前的研究发现，IGF-2能促进胚胎期毛囊发育，从而促进毛囊的生成[19]。综上所述，IGF-1在多种体外培养的毛囊上发挥重要作用，其主要功能是促进毛囊生长并维持毛囊的生长期。而IGF-2是胚胎发育的重要调节因子，在晚期胚胎毛囊的形成中发挥重要作用。目前有关IGF-1和IGF-2对成年牦牛皮肤毛囊生长周期转换的影响仍鲜见报道。因此，本研究采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)和免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)3种方法，分别从基因和蛋白水平检测成年牦牛毛囊生长周期中IGF-1和IGF-2的基因转录水平和蛋白表达情况，以期为牦牛出生后毛囊生长转换的分子调控机制研究提供一定的基础资料。

1 材料与方法

1.1 样品采集

试验动物来自天祝藏族自治县屠宰场的健康成年牦牛，依据Yang等[20]对牦牛毛囊周期的划分，选择毛囊处于生长期、退行期和休止期的牦牛(各10头，3～6岁)。分别取其颈部皮肤，一部分样品固定于4%的多聚甲醛溶液中，用于IHC试验；另一部分样品迅速放置于液氮中，之后移至-80℃冰箱保存，用于qRT-PCR和Western blot试验。

1.2 主要试剂及仪器

IGF-1抗体(DF-6096)，美国Affinity公司；IGF-2抗体(ab-9574)，英国Abcam公司；β-actin(bs-0061R)、二抗(bs-0295G-HRP)，北京博奥森生物技术有限公司；TriQuick总RNA提取试剂盒、RIPA组织裂解液，北京索莱宝科技有限公司；链霉卵白素-生物素法检测(streptavidin peroxidase,SP)试剂盒、二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司；EVO-M-MLV反转录试剂盒，长沙艾科瑞生物工程有限公司；Light Cycler 96实时荧光定量PCR仪，瑞士Roche公司；DP71显微照相装置，日本Olympus公司；Q5000紫外分光光度计，美国Quawell公司；HI1220烘片机，上海徕卡仪器有限公司。

1.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

1.3.1 引物设计与合成根据GenBank中已报道的野牦牛(Bosmutus)IGF-1、IGF-2基因序列以及β-actin内参基因序列，采用Primer Premier 6.0软件设计特异性引物，由北京华大基因合成。引物序列见表1。

表1 目的基因和内参基因引物序列Table 1 Primer sequences of target and house-keeping genes

1.3.2 总RNA提取和cDNA合成取毛囊生长期、退行期和休止期颈部皮肤，研磨后置于冰盒上，用TriQuick总RAN提取试剂盒Reagent法提取总RNA，使用紫外分光光度计测定其浓度和纯度。将提取的不同时期RNA浓度均调到300 ng·μL-1，按照EVO-M-MLV反转录试剂盒说明书步骤将其反转录为cDNA后进行PCR扩增和qRT-PCR试验。

1.3.3 qRT-PCR检测以反转录得到的cDNA为模板，进行qRT-PCR扩增。反应总体系20 μL：10 μL SYBR Green Mix,7 μL ddH2O,2 μL cDNA,上下游引物各0.5 μL。反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸15 s,共40个循环；72℃延伸5 min。每个样品做4个重复，反应结束后利用Light Cycler 96分析其熔解曲线判定样品扩增的特异性，获取每个样品的循环数阈值(cycle threshold value,CT)，运用2-ΔΔCT法进行分析。

1.4 蛋白免疫印迹(Western blot)

1.4.1 蛋白样品制备将采取的毛囊生长期、退行期和休止期颈部皮肤分别研磨，各称取0.1 g于离心管中，分别加入1 mL高效RIPA(radio immunoprecipitation assay)组织裂解液和10 μL苯甲基磺酰氟(phenylm methane sulfonyl fluoride,PMSF)，放置摇床2 h使组织充分裂解，于4℃、12 000×g条件下离心10 min，吸取上清液至新的离心管，用紫外分光光度计测定蛋白浓度。将提取的毛囊生长期、退行期和休止期蛋白样品与4×SDS-PAGE loading buffer按3∶1的比例混合配置蛋白工作液，金属浴(100℃)变性10 min。

1.4.2 Western blot检测用等量变性的蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)，将目的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上，5%脱脂奶粉室温封闭3 h,一抗(IGF-1,1∶1 000稀释；IGF-2,1∶200稀释；β-actin,1∶2 500稀释)孵育，4℃过夜。用磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffer solution tween,PBST)清洗PVDF膜，二抗(Goat Anti-Rabbit IgG/HRP,1∶2 500稀释)孵育，室温1 h，用PBST清洗PVDF膜，电化学发光液(electro-chemi-luminescence，ECL)显色并观察结果。用Image J软件测定各条带灰度值。

1.5 免疫组织化学检测(IHC)

1.5.1 组织切片制备从4%多聚甲醛固定液中取出毛囊生长期、退行期和休止期的皮肤组织，经冲块、脱水、透明、浸蜡和包埋，制成4 μm厚的石蜡切片，置于烘片机上，60℃烘烤6 h。

1.5.2 免疫组织化学染色 (1)下行酒精脱蜡至水，在pH值6.0的0.01 mol·L-1柠檬酸盐缓冲液中微波加热修复抗原15 min，自然冷却至室温。(2)滴加3%过氧化氢溶液(SP试剂盒试剂1)，37℃作用15 min。(3)滴加正常山羊血清(SP试剂盒试剂2)，室温封闭15 min。(4)一抗(IGF-1,1∶400稀释；IGF-2,1∶500稀释)孵育，4℃过夜。(5)复温30 min，生物素标记山羊抗兔IgG(SP试剂盒试剂3)孵育，37℃作用15 min。(6)辣根酶标记链霉卵白素工作液(SP试剂盒试剂4)孵育，37℃作用15 min。(7)DAB显色液适度显色，后用自来水冲洗10 min终止显色。(8)苏木精复染1.5 min，盐酸酒精分化，自来水返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以上步骤除第三步外，其余各步骤间均用PBS洗3次(3 min/次)。阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤不变。

1.6 数据分析

数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示，以单因素方差分析ANOVA(SPSS 25.0)进行统计学分析，P<0.05为差异显著，P> 0.05为差异不显著。用GraphPad Prism 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 qRT-PCR检测IGF-1和IGF-2基因的表达

PCR扩增结果显示，IGF-1 (图1-A)、IGF-2 (图1-B)和β-actin(图1-C) 基因扩增产物大小分别为118、110和80 bp，各个基因的扩增产物大小与预期片段大小相符，引物特异性强，可用于后续qRT-PCR试验。qRT-PCR结果显示，IGF-1基因的相对表达水平在毛囊生长期最高，退行期次之，休止期最低。差异分析显示，IGF-1基因在生长期的相对表达水平显著高于退行期和休止期(图1-D)。IGF-2基因在毛囊生长周期中的相对表达水平与IGF-1基因相似，其在毛囊生长期的相对表达水平显著高于退行期和休止期(图 1-E)。

2.2 Western blot检测IGF-1和IGF-2蛋白的表达

2.2.1 毛囊生长周期中IGF-1蛋白的相对表达 IGF-1蛋白在毛囊生长期皮肤表达水平最高，在退行期和休止期表达水平较低。差异分析结果显示，IGF-1蛋白在毛囊生长期皮肤的表达显著高于退行期和休止期(图2)。

注：A～C：IGF-1,IGF-2和β-actin基因扩增产物,M：GL 2000 DNA 分子标记,1：生长期,2：退行期,3：休止期；D：IGF-1的相对表达水平；E：IGF-2的相对表达水平。不同小写字母表示不同时期之间差异显著(P<0.05)。下同。Note: A-C: IGF-1,IGF-2 and β-actin gene amplification products. M: GL 2000 DNA Marker. 1: Anagen. 2: Catagen. 3: Telogen. D: Relative expression levels of IGF-1. E: Relative expression levels of IGF-2. Different lowercase letters indicate significant differences between different periods at 0.05 level. The same as following.图1 毛囊生长周期中IGF-1及IGF-2的相对表达水平Fig.1 Relative expression levels of IGF-1 and IGF-2 in hair follicle growth cycle

注：A: Western blot结果；B: IGF-1蛋白的相对表达水平。Note: A: Western blot results. B: Relative expression levels of IGF-1 protein. 图2 毛囊生长周期中IGF-1蛋白的相对表达水平Fig.2 Relative expression levels of IGF-1 protein in hair follicle growth cycle

2.2.2 毛囊生长周期中IGF-2蛋白的相对表达 IGF-2蛋白在毛囊生长期皮肤表达水平最高，在退行期和休止期表达水平较低。差异分析结果显示，IGF-2蛋白在毛囊生长期皮肤的表达显著高于退行期和休止期(图 3)。

注：A: Western blot结果；B: IGF-2蛋白的相对表达水平。Note: A: Western blot results. B: Relative expression levels of IGF-2 protein.图3 毛囊生长周期中IGF-2蛋白的相对表达Fig.3 Relative expression levels of IGF-2 protein in hair follicle growth cycle

2.3 IHC检测IGF-1和IGF-2在皮肤毛囊的定位表达

2.3.1 IGF-I在皮肤毛囊生长周期的定位表达在毛囊生长周期转换过程中，IGF-1主要表达于皮肤表皮、毛囊外根鞘和毛母质细胞，在毛乳头细胞和毛囊内根鞘不表达。棕黄色表示IGF-1的阳性表达产物(图4)。

注：A～C: 毛囊生长期皮肤纵切；D～F: 毛囊退行期皮肤纵切；G～I: 毛囊休止期皮肤纵切；J～L: 阴性对照。EP: 表皮；ORS: 外根鞘；IRS: 内根鞘；HM: 毛母质；DP: 毛乳头。Note: A～C: Longitudinal incision of skin in anagen. D～F: Longitudinal incision of skin in catagen. G～I: Longitudinal incision of skin in telogen. J～L: Negative control. EP: Epidermis. ORS: Outer root sheath. IRS: Inner root sheath. HM: Hair matrix. DP: Dermal papilla.图4 IGF-1在皮肤毛囊生长周期的定位表达Fig.4 Localization and expression of IGF-1 in the growth cycle of skin hair follicles

2.3.2 IGF-2在皮肤毛囊生长周期的定位表达 IGF-2在毛囊生长的各个周期皮肤中表达同IGF-1相似，主要表达于皮肤表皮、毛囊外根鞘和毛母质细胞，在毛乳头细胞和毛囊内根鞘不表达。棕黄色表示IGF-2的阳性表达产物(图5)。

注：A～C: 毛囊生长期皮肤纵切；D～F: 毛囊退行期皮肤纵切；G～I: 毛囊休止期皮肤纵切；J～L: 阴性对照。EP: 表皮；ORS: 外根鞘；IRS: 内根鞘；HM: 毛母质；DP: 毛乳头。Note: A～C: Longitudinal incision of skin in anagen. D～F: Longitudinal incision of skin in catagen. G～I: Longitudinal incision of skin in telogen. J～L: Negative control. EP: Epidermis. ORS: Outer root sheath. IRS: Inner root sheath. HM: Hair matrix. DP: Dermal papilla.图5 IGF-2在皮肤毛囊生长周期的定位表达Fig.5 Localization and expression of IGF-2 in the growth cycle of skin hair follicles

3 讨论

早在1962年，Davis[21]就报道了哺乳动物被毛生长呈周期性变化，生长期中毛囊细胞快速增殖分化，与退行期和休止期相互交替，形成周期性循环。Yang等[20]对毛囊生长周期中毛囊的数量及形态变化进行了详细研究，发现生长期毛囊群结构逐渐清晰完整，毛囊数量明显增加；退行期毛囊群开始变得不完整，毛囊的数量开始减少，毛干开始脱落；休止期毛囊群结构松散，只留下退化的外根鞘空腔。研究表明，大量生长因子和激素都参与调控毛囊的周期性循环和形态学变化，其调控机制错综复杂[22]。目前，IGFs已被证明广泛分布在毛囊、毛乳头及真皮纤维细胞内，对毛囊的上皮和真皮均有刺激作用[23]。本试验在此基础上探讨IGF-1和IGF-2对毛囊生长周期转换的影响，结果发现IGF-1和IGF-2在毛囊生长期、退行期和休止期的表达存在差异性，由此推测，IGF-1和IGF-2与毛囊生长周期转换密切相关。

通过检测IGF-1基因及蛋白在毛囊生长周期的表达，发现IGF-1在毛囊生长期皮肤中相对表达水平最高，在退行期和休止期显著低于生长期。这与Bai等[24]在辽宁绒山羊毛囊组织的研究结果一致。此外，魏玉青[25]通过qRT-PCR技术对辽宁绒山羊皮肤中IGF-1的相对表达进行研究，发现IGF-1的表达水平与绒山羊毛发生长时期相关，在毛发生长旺盛时期高表达，在毛囊退行期和休止期明显降低。刘逍等[26]在吉林白鹅毛囊发育过程中检测IGF-1的表达情况，发现IGF-1在毛囊生长期相对表达水平最高。因此推测，IGF-1在毛囊生长期可能具有促进毛囊生长的作用。同时，通过检测IGF-2基因及蛋白在毛囊生长周期的表达，发现IGF-2的表达模式与IGF-1相似，其在毛囊生长期的皮肤中表达量最高，在退行期和休止期表达较弱。Ward等[27]用注射法研究IGF-2对小鼠生长发育的长期影响，发现过表达的IGF-2导致小鼠皮肤过度生长。Baker等[28]研究发现，小鼠体内缺乏编码IGF-2的功能基因没有改变出生后小鼠的生长速度或身体比例，但小鼠表现出表皮发育不良。另有研究表明，IGF-2在胎儿期毛囊形成过程中能够促进毛囊的发育和生长[19]。上述研究都表明了IGF-2对胎儿期小鼠皮肤及毛囊的生长和发育有重要作用。然而，目前对IGF-2的研究都集中在胚胎期或胎儿期，对于其在成年动物机体皮肤及毛囊中发挥的作用尚不清楚。根据本研究IGF-2在毛囊生长周期的表达结果，提示IGF-2在毛囊周期转换过程中可能具有促进毛囊生长的作用。

相关研究认为，毛乳头是毛发再生的信号中心，毛囊的生长是外根鞘隆突部毛囊干细胞和真皮毛乳头共同作用的结果[29]。在1990年Cotsarelis等[30]提出的隆突激活假设中，隆突部细胞在毛囊休止期后期被毛乳头激活并迁出，沿着外根鞘向下迁移，在毛乳头周围分化形成毛母质细胞。生长期毛母质细胞分化能力增强，毛囊不断向下增长，毛干不断增长，随着毛母质细胞分化衰竭，毛囊逐渐进入退行期[31]。研究表明，IGF信号系统能促进毛囊干细胞迁移至毛乳头周围并增殖分化形成毛母质细胞，再通过刺激毛母质细胞增殖，从而促进毛囊的生长，抑制毛囊退行和休止[32-34]。本研究中，IHC结果显示，IGF-1和IGF-2均在毛母质细胞中有阳性表达，提示IGF-1和IGF-2均可能刺激毛母质细胞的增殖分化。同时，前人研究发现，IGF-1在毛囊生长周期中有调控角质形成细胞增殖和分化的作用，而毛囊干细胞生成的外根鞘角质形成细胞，具有促进毛发生长、抑制毛囊退行的作用[35-36]。结合IGF-1和IGF-2在皮肤表皮和毛囊外根鞘均有阳性表达的试验结果，表明IGF-1和IGF-2可能具有促进角质形成细胞增殖和分化能力。然而，本研究在毛囊内根鞘并未检测到IGF-1和IGF-2的表达。毛囊内根鞘细胞是由毛母质细胞自身分化的终末分化细胞[31]，不再分裂增殖，进一步提示IGF-1和IGF-2可能具有刺激毛囊上皮细胞增殖分化的作用。同时，在毛乳头细胞也未检测到IGF-1和IGF-2的表达。Weger等[37]在转基因小鼠毛囊生长期的毛乳头细胞中检测到了IGF-1的表达，但其表达强度与IGF-1的剂量呈依赖关系。因此，IGF-1和IGF-2对毛囊毛乳头刺激作用可能与自身浓度以及所处的生理环境有关。此外，胰岛素样生长因子IGF-1和IGF-2具有自分泌和旁分泌效应，并通过与I型IGF受体结合以旁分泌或自分泌的方式激活Ras/Raf/MAP 激酶和PI3k激酶/Akt通路发挥生物学效应[38-39]。而Tomita等[40]在角质形成细胞中检测到IGF-1受体的存在。同时，在皮肤组织中，IGF-1仅由真皮和毛乳头的间充质细胞合成[41]。综上所述，IGF-1和IGF-2在毛囊周期的调控作用可能通过真皮乳头释放信号以旁分泌的方式结合到有特定I型IGF受体的上皮细胞，刺激毛囊上皮细胞的增殖和分化，从而促进毛囊的生长。

本研究发现，IGF-1和IGF-2在毛囊生长周期转换过程中发挥重要作用，并可能具有协同作用，且该过程可能通过刺激毛囊上皮细胞增殖分化从而促进毛囊生长。然而，毛发的不同步生长，不同物种之间皮肤解剖结构以及生理的差异，对介导毛囊生长周期转换的关键分子决定因素的识别以及调控机制仍需进一步研究。