miR-429 靶向FSTL1基因对非小细胞肺癌生物学功能的影响

郭旭琼，李 硕，赵海燕，洪云川，马 辉

(天津医科大学总医院呼吸内科，天津 300041)

肺癌中80%以上的患者为非小细胞肺癌，由于该病的发病比较隐匿，早期无明显症状，绝大多数患者诊断时已经处于中晚期[1]。虽然术前的新辅助放化疗能够大大提高手术的切除率，但5年的生存率仍只有65%～80%，尤其是对于临床分期Ⅲa以上的患者[2]，虽然在一定程度上改善了治疗效果，但疗效不是很明显，可能与非小细胞肺癌生物学行为具有高度的侵袭性和转移性相关[3]。非小细胞肺癌属于异质性很强的恶性肿瘤，靶向治疗研究成果改善了非小细胞肺癌的现状，但患者的生存率提高仍不明显，所以充分研究非小细胞肺癌的侵袭转移机制，寻找诊断、治疗和预后的相关分子标记物具有非常重要的意义。现已发现超千种微RNA(microRNA，miRNA/miR)与人类的各种疾病息息相关[4]，其具有相对的稳定性和基因表达调控特性，是未来生物标志物和潜在治疗的靶点[5]。miRNA的表达水平变化与细胞的凋亡、分化、增殖等生物学过程有关，推测miRNA可能成为肿瘤启动子或抑制剂及肿瘤诊断和预后的分子标志物[6]。因此，本研究将通过分析miR-429与卵泡抑素样蛋白l(follistatin-like protein 1,FSTL1)基因的靶向关系，确定其对非小细胞肺癌预后和生物学功能的影响，为临床非小细胞肺癌的治疗及预后提供有价值的参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2020年1月至2021年6月本院行根治性切除术的60例非小细胞肺癌患者的肿瘤组织(病灶处剪取直径3～4 mm的组织块)和癌旁组织(距离病灶5 cm剪取相应的组织块)。收集的标本立即放入—80 ℃的液态氮中保存。纳入标准：(1)患者未接受过放疗、化疗；(2)经病理学诊断确诊为非小细胞肺癌患者；(3)根据国际癌症联合会(UICC)第八版的术后病理分期标准确定入组患者的病理结果。排除标准：(1)患者有严重的基础性疾病；(2)合并其他恶性肿瘤的患者。本研究经过医院伦理委员会批准并经过患者知情确认。

1.2 方法

1.2.1实时荧光定量PCR检测miR-429的表达

将组织标本在液态氮中研磨，采用Trizol试剂盒提取组织和H1299细胞的总RNA，按照试剂盒的操作说明进行操作。并采用微量核酸定量光谱仪测定RNA的浓度和纯度。使用invitrogen逆转录试剂盒superscriptⅢ进行逆转录操作。然后进行PCR扩增，建立扩增体系20 μL，于ABI 7900 qPCR仪上，按照反应条件95 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40个循环，引物序列为miR-429上游5′-GAT AUG TAU CUT GCA UUG UTU-3′，下游5′-GAU TAG CAT CUG TUG UCG-3′；GAPDH作为内参，引物序列为上游5′-GAT AAG CAU CUT GUG TCG-3′，下游5′-AUT CTA ATU CTG CUT CAG U-3′，用相对定量2-ΔΔCT计算组织和细胞中miR-429表达水平，然后按照组织miR-429表达依据中位数法进行分组，分为miR-429高表达和低表达，分析患者的临床特征和预后情况。

1.2.2细胞培养

采用10%胎牛血清培养基常规培养非小细胞肺癌细胞系SPCA1、A549、H460、H1299和正常肺支气管上皮细胞BESA-2B，在5% CO2、37 ℃的培养箱中，使用0.25%胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养。

1.2.3细胞转染和分组

细胞转染参照LipofectamineTM2000试剂说明书上的步骤进行，将H1299细胞接种于6孔板中，当H1299细胞融合度达到80%左右时，将miR-NC、miR-429 mimics采用LipofectamineTM2000分别进行转染作为miR-429 NC组、miR-429 mimics组，设置对照组，对照组H1299细胞不做任何处理。构建pcDNA-FSTL1的表达载体，应用LipofectamineTM2000将pcDNA3.1-con和pcDNA-FSTL1分别转染至高表达miR-429的H1299细胞中，作为miR-429 mimics+pcDNA3.1组和miR-429 mimics+pcDNA-FSTL1组。转染48 h后收集细胞，并进行后续实验。

1.2.4Transwell检测细胞侵袭

将Transwell上室中的8 μL Matrigel采用血清培养基进行稀释，然后放入小室，37 ℃条件下孵育60 min，将500 μL的含10% FBS的完全培养基加入Transwell下室，将各组H1299细胞以5×104个/mL接种于上室，孵育24 h，取出Transwell上室，4%的多聚甲醛固定20 min，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，风干，1%结晶紫染色30 min后，晾干，将聚碳酸酯膜放于载玻片中，封片，置于倒置显微镜下对细胞进行拍照计数。

1.2.5细胞划痕实验检测细胞迁移

将各组H1299细胞以2×106接种于6孔板中，待细胞融合，采用200 μL枪头在中央区域画一条横线，更换培养基，去除划下的细胞，放入37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，0、48 h取样，拍照，计算迁移率，迁移率=(初始划痕的宽度值-相应点的划痕宽度值)/初始划痕宽度值×100%。

1.2.6双荧光素酶报告实验

通过Targetscan网站(http://www.targetscan.org/vert_71/)预测miR-429在FSTL1 mRNA的3′-UTR处的潜在结合位点。从基因组DNA中扩增FSTL1的3′-UTR，并在FSTL1控制载体的终止密码子下游克隆。该结构为野生型和突变型，使用位点定向诱变试剂盒进行PCR扩增，将荧光素酶报告载体与miR-429 NC和miR-429 mimics共转染到H1299细胞中，48 h后双荧光素酶分析。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 miR-429在非小细胞肺癌组织和细胞中的表达情况

非小细胞肺癌组织miR-429相对表达水平明显低于癌旁组织(P<0.05)。非小细胞肺癌细胞系SPCA1、A549、H460、H1299中miR-429相对表达水平明显低于正常肺支气管上皮细胞BESA-2B(P<0.05)，其中H1299细胞表达最低，所以后续采用H1299细胞继续实验，见图1。

A：miR-429在非小细胞肺癌组织和癌旁组织中的表达情况；B：miR-429在不同非小细胞肺癌细胞系及正常肺支气管上皮细胞中的表达情况；a：P<0.05，与癌旁组织比较；b：P<0.05，与BESA-2B比较。

2.2 miR-429表达与患者临床特征的相关性分析

miR-429高表达和低表达患者的肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 miR-429表达与患者临床特征的相关性分析[n=30,n(%)]

2.3 miR-429表达对非小细胞肺癌患者预后的影响

Kaplan-Meier和Log-rank检验结果显示，miR-429高表达患者中位生存时间为49个月，miR-429低表达患者为37个月，miR-429高表达患者的生存率明显优于低表达患者(Log-rankχ2=6.915，P=0.019)，见图2。

图2 miR-429表达与非小细胞肺癌患者总体生存相关性

2.4 miR-429对H1299细胞侵袭的影响

对照组和miR-429 NC组H1299细胞侵袭数量比较，差异无统计学意义(P>0.05),miR-429 mimics组H1299细胞侵袭数量明显低于对照组和miR-429 NC组(P<0.05)，见图3。

2.5 miR-429对H1299细胞迁移的影响

对照组和miR-429 NC组H1299细胞的愈合能力比较，差异无统计学意义(P>0.05),miR-429 mimics组H1299细胞的愈合能力明显低于对照组和miR-429 NC组(P<0.05)，见图4。

A：细胞侵袭检测图(Transwell，200×)；B：转染后穿膜细胞侵袭数量柱状图；a：P<0.05，与对照组和miR-429 NC组比较。

A：细胞迁移检测图(50×)；B：转染后细胞愈合率柱状图；a：P<0.05，与对照组和miR-429 NC组比较。

2.6 miR-429靶向FSTL1关系

TargetScan网站发现了FSTL1的3′-UTR区域具有miR-429的靶向结合位点，荧光素酶报告结果显示，与miR-429 NC组比较，miR-429 mimics组野生型FSTL1报告基因的荧光素酶活性明显降低(P<0.05)，但突变型的荧光素酶活性并没有发生改变(P>0.05)，见图5。

2.7 miR-429靶向FSTL1对H1299细胞侵袭和迁移的影响

miR-429 mimics组H1299细胞侵袭数量和愈合率明显低于对照组(P<0.05)；miR-429 mimics组和miR-429 mimics+pcDNA3.1组H1299细胞侵袭数量和愈合率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；miR-429 mimics+pcDNA-FSTL1组H1299细胞侵袭数量和愈合率明显高于miR-429 mimics组(P<0.05)，见图6。

A：miR-429靶向FSTL1关系；B：双荧光素酶报告基因试验证实靶向关系;a:P<0.05，与miR-429 NC组比较。

A、B:细胞侵袭检测图(Transwell,200×)及定量分析；C、D：细胞迁移检测图(50×)及定量分析；a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与miR-429 mimics组比较。

3 讨 论

肺癌根据病理分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌是癌变所导致死亡的最主要原因[7]。非小细胞肺癌的发病原因还尚不明确，多数研究表明环境、吸烟、遗传因素、职业接触及慢性肺部感染是发病的危险因素[8]。由于该病临床表现缺乏特异性，一些患者确诊时已为晚期，失去了最佳治疗的时间，虽然手术、放化疗、分子靶向治疗等多项治疗手段已经取得了重大的突破，但非小细胞肺癌的5年总生存率也仅为15%左右[9]。非小细胞肺癌的发生、发展是多种基因参与的复杂的生物学过程，相关研究发现，肿瘤基因、肿瘤生长因子、细胞的侵袭和迁移等在非小细胞肺癌的治疗和预后起着重要的作用[10]。

miRNA对基因翻译有着非常大的影响，人类基因中50%以上是由miRNA调控的[11]。另外每个miRNA可以调节大量的靶基因，通过miRNA靶基因的调节形成一个相互作用复杂的网络，允许miRNA调控细胞的全面活动，包括细胞的增殖、凋亡、细胞周期、侵袭、迁移及血管的形成[12]。miRNA广泛参与人类的各种疾病，包括肿瘤。在不同的肿瘤中，miRNA已经被证明是早期诊断和预后的潜在标记物。miR-429属于miR-200家族的成员之一，是具有抑癌作用的miRNA，该家族具有高度保守性及组织特异性等生物学特征[13]。最新研究报道，miR-429在几种肿瘤中的表达降低，发挥着抑癌作用，可以作为早期检测和预后的分子标记物[14]。FSTL1基因定位于3q13染色体，属于一种分泌性糖蛋白，由308个氨基酸组成[15]。近年来，关于FSTL1基因的研究主要集中在自身免疫性疾病、免疫调节、炎症和缺血后血管重构，鉴于FSTL1基因在炎症中发挥着特殊的作用[16]，所以在肿瘤的发展中引起了研究者的兴趣。相关研究发现，FSTL1基因在肿瘤发生、发展的过程中发挥着双重调控的作用[17]，但确切的机制尚不明确，所以本研究探讨miR-429对非小细胞肺癌预后和生物学功能的影响及对FSTL1基因的调控机制，结果发现miR-429对非小细胞癌的早期诊断和预后起到至关重要的作用。

本研究首先通过实时荧光定量PCR检测miR-429的表达，结果显示miR-429在非小细胞肺癌组织和细胞系中高表达，且miR-429表达与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期具有一定的关系，且miR-429高表达患者的生存率明显优于低表达患者。为了验证miR-429在非小细胞肺癌中的作用，采用Transwell和细胞划痕实验检测细胞侵袭和迁移，结果显示，高表达miR-429可以抑制H1299细胞的侵袭和迁移。随后通过Targetscan网站预测miR-429在FSTL1 mRNA的3′-UTR处的潜在结合位点，并通过双荧光素酶报告实验证明，miR-429 mimics组野生型FSTL1报告基因的荧光素酶活性明显降低。接着构建pcDNA-FSTL1的表达载体，经pcDNA-FSTL1转染到高表达miR-429的H1299细胞中，结果显示，miR-429 mimics+pcDNA-FSTL1组中H1299细胞侵袭数量和愈合率高于miR-429 mimics组。提示高表达miR-429可以促进FSTL1的表达，从而起到抑制细胞侵袭和迁移的作用。相关研究表明，高表达miR-429可以诱导非小细胞肺癌A549细胞株的增殖、侵袭和转移，并靶向RASSF8、PTEN等基因调控肿瘤的发生、发展[18]，与本研究类似。

综上所述，本研究初步探讨了miR-429在非小细胞肺癌中的作用，验证了miR-429靶向FSTL1关系，通过靶向FSTL1基因调控非小细胞肺癌细胞的侵袭和迁移的作用，为非小细胞肺癌的分子靶向治疗提供有价值的参考。