间作分蘖洋葱对番茄氮素吸收和根际土壤微生物多样性的影响

吴 瑕，胡艺琛，杨凤军，苏春杰，汪秀志，吴凤芝

（1 黑龙江八一农垦大学农学院，黑龙江大庆 163319；2 东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨 151103）

氮是陆地生态系统中限制生产力的主要因素，铵态氮和硝态氮是植物吸收利用的主要无机态氮形式，土壤可通过氨化、硝化及反硝化作用将氮素从有机态转化为无机态供植物吸收[1]。氮肥也是我国消费量最大的化学肥料，约占化肥总量的 2/3。我国单位面积氮肥用量远高于世界平均水平。设施中长期过量施用氮肥还会使设施土壤中硝态氮含量升高，减少土壤中硝化微生物菌群的丰度，提高反硝化微生物的活性，促进N2O排放量的增加[2]。研究证实，农业生态系统中氮素转化多样性和氮循环的复杂性致使氮损失。如何通过氮素的优化管理，将氮损失降到最低是学者们关注的焦点问题[3]。近年来，通过轮作、间套作及伴生等栽培模式能够改变植株根际土壤微生物群落结构，提高氮素的利用[4]。因此，研究间套作根际土壤中微生物数量及群落结构的变化，对了解根际氮营养具有重要意义。

间套作可以显著改善植株的氮营养，提高系统氮素吸收量。豆科与禾本科间套作能够促进植株对氮的吸收[5]。间作促进氮养分由营养器官向生殖器官转移，适量施氮条件下间作油菜籽粒氮吸收量达到最大值[6]。间套作系统中非豆科作物间对氮竞争作用较强，通过合理选择间套作品种或者错开作物氮素利用时期，从而促进氮的高效利用[7]。间套作系统改善了共生作物和根际微生物的生长环境，促进土壤中氮素循环及转化，提高作物对氮素的吸收和利用[8]。研究证实，甘蔗间作大豆模式土壤硝态氮含量较单作高，说明间作有利于土壤保持肥力，为甘蔗后期生长提供足够的养分[9]，减施氮肥(N 75 kg/hm2)不会影响间作体系产量，还可降低后茬小麦表层土壤中硝态氮的残留[10]。甘蔗-大豆间作模式能够提高土地利用率，同时减量施氮能保护农业生态环境[11]。设施栽培中为追求高产所投入的氮肥量不断增加，导致种植多年的蔬菜大棚土壤氮素供应水平较高，氮肥利用率很低。因此，在多年连作的土壤肥力水平较高的设施蔬菜生产中，运用合理的栽培模式和氮肥的优化施用来提高氮肥利用率仍值得进一步研究[12]。

分蘖洋葱(AlliumcepaL.var.AggregatumG.Don)在我国黑龙江和吉林等地广泛种植，其鳞茎中含有大蒜素等多种植物杀菌素，其中槲皮素等成分对番茄枯萎病病原菌生长具有较好的抑制作用[13]，分蘖洋葱对土壤有杀菌消毒作用，在栽培中间作分蘖洋葱已被人们所接受[14-15]。研究证实，间作分蘖洋葱可显著改善土壤微生物群落结构，减轻黄瓜霜霉病和白粉病等病害的发生，提高产量[16]。番茄(SolanumlycopersicumL.)在蔬菜作物中位居首位，全球年总产量达 1.7 亿t，是我国设施栽培面积较大的果菜之一[17]。设施番茄对氮肥吸收利用率很低，致使氮肥流失严重已成为制约设施番茄生产的主要问题。笔者前期研究发现，间作分蘖洋葱提高了番茄磷和锰等养分的吸收，降低了番茄灰霉病发病率[18]，间作分蘖洋葱促进植株生长，提高产量5%～8%[19]，但间作对氮吸收及生物机理不明。因此，本试验以茄科连作8年以上的设施土壤为基质，研究分蘖洋葱-番茄间作系统植株根际土壤中氮吸收和根际微生物多样性的变化，旨在分析间作分蘖洋葱改善番茄氮营养的生物学机制，为间作栽培模式促生增产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2014年2月至12月在东北农业大学园艺系大棚和实验室进行。供试番茄品种为月光(东农708)，由东北农业大学番茄课题组提供。供试分蘖洋葱由黑龙江省农安和五常市红旗社村提供。

供试土壤为黑土，其基本理化性质为pH 6.61(土水比为1∶2.5)、电导率(EC)为1.5 mS/cm、有机质25.20 g/kg、全氮1.58 g/kg、碱解氮91.00 mg/kg、速效磷243.43 mg/kg、速效钾323.30 mg/kg。

1.2 试验设计

为测定间作对番茄各部位氮养分吸收及产量的影响进行了田间试验，田间试验在茄科连作8年以上棚室内进行。试验设番茄单作、番茄与分蘖洋葱(品种为五常)间作及番茄与分蘖洋葱(品种为农安)间作，共3个处理，每处理3个小区，小区面积为0.6 m×3.25 m，番茄株行距为25 m×30 cm，单作处理每小区定植2行番茄，共26株。间作处理在番茄外侧距植株5 cm处以1∶4的比例单瓣直播分蘖洋葱鳞茎，分蘖洋葱株距10 cm，间作处理每小区定植番茄26株及分蘖洋葱104株。定植前撒施腐熟的猪粪37500 kg/hm2(营养含量为15%有机质、0.5%N、0.5% P、0.4% K)，按照150 kg/hm2量穴施硫酸钾型复合肥(养分含量 ≥ 45%，N∶P2O5∶K2O为12∶18∶15)。整地后于番茄7叶1心时定植，分蘖洋葱一般在番茄定植后7天栽种，采用单因素随机区组设计，番茄常规管理，留3穗果摘心(60天)。每小区随机抽选5株挂牌，分别于番茄定植后30、60、90 天进行生长指标的调查，测定番茄产量，并于90天时测量番茄植株各部位干样中氮含量及氮吸收量，统计平均值。

为测定间作对番茄根际土壤微生物多样性的影响进行盆栽试验，盆栽试验设番茄单作、番茄与分蘖洋葱(五常)间作、分蘖洋葱单作及无苗对照共4个处理，设置无苗对照作为土壤环境的参考值，番茄单作每盆定植1 株番茄；间作每盆定1 株番茄和4株分蘖洋葱，分蘖洋葱株距5 cm，在番茄外侧环绕半周；分蘖洋葱单作每盆种植4 株，均匀分布盆中，株距5 cm。试验每处理3 次重复，每重复30盆，每处理种植90 盆，盆栽试验共计360 盆。采用单因素随机区组设计，随机摆放。试验采用体积为24 cm×17 cm的塑料盆，取茄科植物连作8年以上的大棚连作土，每盆装土2.5 kg，将土拌匀过筛装盆，按照每盆施加硫酸钾型复合肥(养分含量 ≥ 45%，N∶P2O5∶K2O为12∶18∶15) 7 g，试验区边缘设保护行。番茄常规育苗，5 叶1心时定植。分蘖洋葱的鳞茎按4∶1与番茄苗同时定植于盆中。试验期间不喷施任何药剂，人工定期除草，定量浇水保证番茄未处于干旱胁迫。分别在定植后23、30和37天3个时期取样，每重复随机选取5 盆采用抖根法[20]并用毛刷刷取根系周围土壤混合作为一个土样，间作处理将番茄和分蘖洋葱根系分开收集根际土壤。土样过1 mm筛后，一部分自然风干测定土壤铵态氮和硝态氮含量；一部分土样存于4℃冰箱中用于土壤酶活性测定；一部分土样存于-80℃冰箱用于土壤DNA提取及Miseq测序。

1.3 测定方法

干物质分配指数(茎、叶和果)指一段时间内地上部的各个器官的生物量占地上部总生物量的百分比。以分配指数定量描述地上部各器官干物质的分配动态[21]。地上部分分配指数(PIS1)指的是地上部分干重占总干重的比例。PIS1=WSH/B，其中，WSH 为地上部分干重 ( g/株)，B为总干物量(g/株)。根分配指数(PIR)指的是地下部分干重占总干重的比例，PIR=1-PIS1。茎、叶、果各器官的分配指数分别用PIS2(PIS2=WS/WSH)、PIL (PIL=WL/WSH)、PIF(PIF=WF/WSH)表示，式中，WSH为地上干物质总重，WS、WL、WF 分别为番茄茎、叶和果干重(g/株)[22]。

称取烘干粉碎的植物样品0.10 g，采用浓H2SO4-H2O2法消煮—-靛酚蓝比色法测定植株全氮含量[23]。采用苯酚-次氯酸钠比色法测定土壤脲酶；采用TTC染色法测定土壤脱氢酶[24]；风干土样采用2 mol/L KCl浸提，流动分析仪测定土壤铵态氮及硝态氮含量。-80℃保存的土样进行基因组DNA提取，由上海美吉生物公司对土壤微生物Miseq测序，对细菌V3～V4区和真菌ITS区进行PCR扩增，引物分别为V338F-V806R、ITS1737F-ITS2-2043R，然后将PCR产物用QuantiFluor™-ST 蓝色荧光定量系统(Promega 公司)进行定量分析，然后通过Miseq文库构建，测序，获得DNA片段的序列[25]。

1.4 数据处理及分析

原始数据的整理采用Microsoft Excel (Office 2003)软件，数据处理采用SAS 9.1.3软件，方差分析使用ANOVA过程 (Duncan's 新复极差法，P＜0.05)。测序数据利用生物信息分析方法进行统计学和可视化分析，最终获取优化有效序列统计，OTU分布统计，进行多样性指数分析和样本群落组成分析，并绘制Heatmap图[25]。

2 结果与分析

2.1 间作两种分蘖洋葱对番茄生长及产量的影响

与番茄单作相比，间作30天后，农安间作番茄株高显著增加，而五常间作番茄株高变化不显著；两种分蘖洋葱间作30 天番茄的鲜重显著高于单作，而间作30天番茄干重变化不显著。间作60 天后，两种分蘖洋葱间作番茄株高均显著增加，间作番茄茎粗无显著变化。农安间作60 天番茄鲜重和干重均显著高于单作；五常间作60 天番茄鲜重显著增加，而五常间作番茄60 天干重增加不显著。两种分蘖洋葱间作90 天后，番茄鲜重和干重增加均不显著。间作两种分蘖洋葱均促进了番茄单株产量和平均单果重的增加，间作提高番茄产量达8.49%～16.92%，但均未达到显著水平(表1)。

表1 间作两种分蘖洋葱对番茄生长及产量的影响Table 1 Effects of intercropping two potato onions on growth and yield of tomato

2.2 间作两种分蘖洋葱对番茄氮养分分配的影响

间作两种分蘖洋葱对番茄干物质分配指数的影响表现出相似的规律。与单作相比，间作番茄初果期(30 天)和盛果期(60 天)干物质在根的分配指数降低，在地上部的分配指数增加，其中在叶的分配指数降低，在花果的分配指数增加了 9.34%～19.10%。间作60 天后，与单作比较，五常和农安两品种间作番茄的根、茎和叶干重占比降低，而花果干物质占比分别增加了8%、5%。间作90 天后，番茄进入果实采收期，间作番茄根、茎中的干物质分配指数增加，而在果实的分配指数降低，与单作比较，间作处理番茄根和茎的干物质分配指数增加了13.83%～70.83% (表2)。

间作90 天后，与单作相比，农安和五常间作番茄的根和茎中氮含量显著增加，且间作五常番茄根中氮含量显著高于农安，两品种洋葱间作后番茄的叶中氮含量显著降低，而间作对番茄花和果中氮含量影响不同，农安间作显著降低番茄果实中氮含量，而五常间作显著增加了番茄果实中氮含量。间作两品种分蘖洋葱均显著提高了番茄根、茎和叶中氮吸收量，且五常间作处理各器官氮吸收量显著高于农安间作处理，同时五常间作后番茄的花和果中氮吸收量也显著高于农安间作和单作番茄。两种分蘖洋葱间作90 天后，均显著提高了番茄的氮养分向根和茎分配比例，而降低氮向叶中分配比例，两品种洋葱间作对番茄植株氮养分分配的影响表现出相似的规律 (表2)。

表2 间作分蘖洋葱对番茄各部位干物质分配指数的影响Table 2 Dry matter distribution index in different parts of tomato under different days of intercropping with potato onions

2.3 间作对番茄根际土壤中氮含量和酶活性的影响

与无苗对照相比，间作提高了番茄根际土壤中铵态氮含量，在间作30和37 天达到显著水平；在间作23和30 天时，单作番茄根际土壤铵态氮含量显著高于无苗对照，而到间作37 天时显著低于无苗对照。单作和间作番茄根际土壤中硝态氮含量始终显著低于无苗对照，且间作处理又显著低于单作处理(图1 A、B)。间作30和37天时分蘖洋葱根际土壤中铵态氮和硝态氮均低于单作和无苗对照(图1 C、D)。综上，间作促进了番茄根际土壤铵态氮活化和硝态氮的吸收。

图1 间作对番茄和分蘖洋葱根际土壤铵态氮与硝态氮含量的影响Fig.1 Ammonium and nitrate nitrogen content in the rhizosphere of tomato and potato onion as affected by intercropping

番茄生育期间，无苗对照土壤两种酶活性变化最小。间作番茄、分蘖洋葱根际土壤脲酶活性均显著高于无苗对照，间作23和37天时番茄根际土壤脲酶活性又显著高于单作(图2 A)；间作分蘖洋葱根际土壤脲酶活性低于单作，在定植30 天达到显著水平(图2 C)。番茄生长期间，间作番茄根际土壤脱氢酶活性在定植30和37 天显著高于单作，且二者均高于无苗对照(图2 B)。间作分蘖洋葱根际土壤脱氢酶活性定植37 天显著高于单作和无苗对照(图2 D)。

图2 间作对番茄和分蘖洋葱根际土壤脲酶与脱氢酶活性的影响Fig.2 Soil urease and dehydrogenase activities in the rhizosphere of tomato and potato onion as affected by intercropping

2.4 间作对分蘖洋葱和番茄氮含量及吸收量的影响

盆栽试验结果(图3)显示，间作后番茄植株内全氮含量变化不显著，而间作番茄的氮吸收量显著增加。分蘖洋葱间作后植株全氮含量显著增加，而间作分蘖洋葱的氮吸收量显著降低。分蘖洋葱和番茄间作促进了番茄对氮的吸收，减少分蘖洋葱对氮的吸收，验证了间作系统种间促进和种间竞争作用同时存在，而番茄在间作体系中处于竞争上位，间作通过竞争促进了番茄对氮养分的吸收。

图3 间作和单作分蘖洋葱和番茄植株的氮含量与氮吸收量Fig.3 Nitrogen content and uptake of potato onion and tomato plant under monocropping and intercropping

2.5 间作分蘖洋葱对番茄根际微生物丰富性的影响

盆栽土壤测序结果显示，间作分蘖洋葱改变了番茄根际土壤中细菌和真菌群落多样性指数(表3，表4)，提高了番茄根际土中放线菌纲、拟杆菌纲、黄杆菌纲、绿菌纲、绿弯菌纲、厌氧绳菌纲、异常球菌纲、芽孢杆菌纲、梭菌纲、柔膜菌纲、浮霉菌纲、α-变形菌纲、丰佑菌纲等细菌的丰度，降低了座囊菌纲、散囊菌纲、盘菌纲、锤舌菌纲、银耳纲、伞菌纲、微球黑粉菌纲、壶菌纲等真菌的丰度(图4)。间作提高了番茄根际土壤中芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)等细菌的相对丰度，提高了番茄根际土壤青霉菌属(Penicillium)、曲霉菌属(Aspergillus)和毛壳菌属(Chaetomium)等真菌的丰度，但却降低了散囊菌属(Eurotium)和梭孢壳属(Thielavia)的丰度(图5)。间作番茄根际细菌菌群结构与间作分蘖洋葱聚类在一起，相似性较大，然后单作番茄及分蘖洋葱根际土壤菌群聚在一起；间作番茄根际细菌菌群结构与单作番茄聚类较远，差异较大(图6)；间作番茄根际真菌菌群结构与单作番茄聚类在一起，相似性较大(图7)，说明间作分蘖洋葱对番茄根际土壤细菌菌群结构影响较大，而对真菌菌群结构影响较小，间作番茄根际土壤微生物菌群结构的改变可能是促进番茄氮养分吸收的关键因素之一。

图4 间作分蘖洋葱和番茄根际土壤细菌(A)与真菌(B)类群纲水平相对丰度Fig.4 Relative abundance of bacteria (A) and fungi (B) at class level in the rhizosphere soil of intercropped potato onion and tomato

图5 间作分蘖洋葱和番茄根区土壤细菌(A)与真菌(B)类群属水平相对丰度Fig.5 Relative abundance of bacteria (A) and fungi (B) at genus level in the rhizosphere soil of intercropped potato onion and tomato

图6 间作分蘖洋葱和番茄根际土壤细菌在科水平上的相对丰度Fig.6 Relative abundance of bacterial taxa in the rhizosphere soil of intercropped potato onion and tomato

图7 间作分蘖洋葱和番茄根际土壤真菌在科水平上的相对丰度Fig.7 Relative abundance of fungal taxa in the rhizosphere soil of intercropped potato onion and tomato

表3 间作分蘖洋葱37天对土壤细菌多样性的影响 (相似度97%)Table 3 Diversity indices of soil bacteria after 37 days of intercropping of potato onion (at the 97% similarity level)

3 讨论

本研究结果显示，两种分蘖洋葱间作60 天后番茄株高和鲜重均显著增加，间作提高产量达8.49%～16.92%，间作60 天时干物质向果实积累增加，间作90 天时干物质向根茎积累增加。分蘖洋葱与番茄间作栽培能促进干物质向生长中心分配，这与覃潇敏等[26]研究结果相似。前人研究表明，合理施氮能够促进植株干物质积累[27]，促进营养器官中干物质向籽粒转移[28]，说明干物质分配用来预测产量是可靠的。研究假定同化物首先在地上与地下间进行优先分配，其次地上部各器官茎、叶、果之间进行核心库分配[21]。本研究结果显示，间作分蘖洋葱60 天后番茄花和果部分干物质分配指数和比例均显著增加，而叶部分干物质分配指数和比例均显著降低。可见，间作分蘖洋葱提高了番茄干物质积累，且干物质向生长中心分配比例增加，这是间作提高番茄产量的主要原因之一。本研究中间作的两个分蘖洋葱品种均提高了番茄的产量，但间作对番茄的长势(株高和茎粗)影响有所不同。白晶芝等[29]研究表明，不同分蘖洋葱品种间作对番茄生长影响不一。套作化感潜力强的品种有利于促进番茄的生长，增强其抗逆性[30]，因此，分蘖洋葱可能通过根系分泌物种类和含量的差异而对番茄根际土壤养分环境产生不同的影响，在今后的研究中将深入分析。

间套作植物养分吸收量增加以及养分利用率提高为增产提供营养基础[31]。本研究表明，分蘖洋葱间作番茄氮吸收量超过了单作番茄，间作番茄养分吸收量显著增加为植株产量提高奠定了营养基础，这与前人对玉米/花生[32]套作体系的研究结果相近。本研究中番茄间作分蘖洋葱改变了番茄植株中氮分配规律，间作两品种分蘖洋葱均减少了番茄养分向叶中分配比例，增加了养分向根和果中分配的比例，提高植株养分利用效率。间作番茄养分吸收量的增加，改变植株内养分的分配指数，番茄盛果期植株体内营养元素已从叶向果实转运，从而促进了果实的生长和成熟[33]，这可能是间作增加产量的主要原因之一。付学鹏等[34]研究表明，根系分泌物中的铵态氮和氨基酸态氮作为作物的氮源，间套作提高了土壤的酶(如脲酶)活性，促进了有机氮向无机氮的转化，提高了土壤无机氮的浓度，增加间套作系统中的氮营养。刘进平等[35]研究表明，土壤中和合理配比更有利于根的生长，促进植株养分的吸收。本研究结果显示，间作分蘖洋葱后番茄根际土壤土壤中脲酶活性提高，铵态氮含量增加，硝态氮含量降低，间作番茄根际土壤中铵态氮和硝态氮合理比例能促进番茄根系生长，而间作土壤中硝态氮含量显著降低可能是植株大量吸收氮养分的结果。间作栽培体系中种间促进和种间竞争作用同时存在，番茄在种间竞争中通过根系快速生长，占据

有利空间生态位，而间作分蘖洋葱的干重显著低于单作[36]。研究表明，土壤中铵态氮和硝态氮含量与主要预测因子氨氧化细菌(AOB)丰富度相关[37]，微生物功能基因的变化对微生物影响养分吸收密切相关，将在今后的研究中进一步深入探讨。

前人研究显示，堆肥中细菌的核心菌群通过将高分子生物有机氮转化为低分子生物有机氮，提高了土壤中氮的有效性，而减少氮的损失[38]。在水稻苗期，减施氮肥同时增施有机氮肥土壤中可培养细菌、真菌、放线菌及芽孢杆菌数量明显提升[39]。芽孢杆菌能显著促进番茄苗株高、鲜重和干重的增加，降低番茄立枯病和早疫病发病率[40-41]。研究显示，假单胞菌RFNB3作为固氮菌对番茄的株高和干物质积累有显著的促进作用[42]。本研究中间作分蘖洋葱提高了番茄根际土壤芽孢杆菌属(Bacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)相对丰度，这两种菌可能作为间作番茄根际土壤中核心菌属促进土壤中生物有机氮的转化，从而提高氮的利用率。鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)为固氮菌属一种，但促生作用不明显[42]，其属于变形菌门a-变形菌纲，它可以降解芳香族化合物[43]，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)属于改变土壤生态功能的一种细菌，在防止土壤退化中起重要作用[44]。本研究表明，间作分蘖洋葱提高了番茄根际土壤中鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)的丰度，这与间作分蘖洋葱改善番茄生态环境及功能密切相关。前人研究证实，在接种青霉菌的土壤中，小麦生长吸收难溶性磷占总吸收的18%[45]。范丙全等[46]研究显示，青霉菌P8在高磷和低磷土壤中均能提高磷利用率，促进作物生长。一些曲霉菌属能够矿化难溶的有机磷酸盐[47]。毛壳菌(Chaetomiumspp.)在自然界广泛分布，并对许多植物病原菌通过营养竞争和产次生代谢产物有潜在的生防作用[48]，应具有安全、高效、低毒的优点[49]。本研究结果显示，与单作番茄比较，间作番茄真菌提高了青霉菌属、曲霉菌属和毛壳菌属的丰度，同时降低了散囊菌属和梭孢壳属等的丰度，推测间作分蘖洋葱后土壤微生物多样性的变化可能与间作番茄根际养分高效利用及植株促生控病密切相关。

4 结论

间作分蘖洋葱改变了番茄根际土壤微生物多样性，提高了番茄根际土壤芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)等细菌的相对丰度，提高了番茄根际土壤青霉菌属(Penicillium)、曲霉菌属(Aspergillus)和毛壳菌属(Chaetomium)等真菌的相对丰度，降低了散囊菌属(Eurotium)和梭孢壳属(Thielavia)真菌的相对丰度，因此改变了番茄根际土壤细菌和真菌的菌群结构，构建了一个氮素转化快、生物活性高的健康根际环境，为番茄生长奠定了基础。田间试验充分证明了间作分蘖洋葱促进番茄生长，提高番茄产量的显著效果。