病毒miRNA检测与早产儿脑室周围白质软化症关系的研究

吴秋萍 李 宏 文香淑 陈 姗 刘丽娟

1.珠海市妇幼保健院儿童脑发育与康复科，广东珠海 519000；2.南方医科大学珠江医院儿科，广东广州 510000

脑室周围白质软化症（periventricular leukomalacia in preterm infants，PVL）是早产儿常见的脑损伤方式，围生期的感染及炎症影响也是PVL大脑白质损伤的原因[1-2]，Gibson等[3]检测了443例脑瘫患儿和883例健康对照儿童中单纯疱疹病毒1型（herpes simplex virus 1，HSV1）、单 纯 疱 疹 病毒2型（herpes simplex virus 2，HSV2）、巨 细 胞 病毒（cytomegalovirus，CMV）、EB病 毒（epstein-Barr virus，EBV）等嗜神经病毒核酸的表达含量，发现脑瘫患儿在围生期高度暴露于上述疱疹病毒和肠道病毒中。本研究前期应用miRNA基因芯片检测PVL早产儿及5例健康早产儿外周血清中miRNA的表达[4]，其中有差异表达显著的4个病毒miRNA：sv40-miR-S1-5p、ebv-miR-BART8-3p、hsv1-miRH6-5p、hsv2-miR-H10，提示相关病毒感染引发炎症反应可能参与PVL的发病。本研究应用生物学信息分析方法和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进行验证miRNA基因芯片检测结果，以证明病毒miRNA与PVL发表的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

将2013年1月至2021年8月于南方医科大学珠江医院就诊的7例早产儿PVL的患儿作为试验组，5例健康早产儿为对照组。纳入标准：试验组患儿有早产病史（胎龄小于37周），生后有运动发育迟缓的临床表现，查体有肢体肌张力增高，膝腱反射亢进，踝阵挛阳性等锥体束征阳性表现，头颅磁共振检查有侧脑室周围白质软化的病灶表现。排除标准：患有遗传代谢病、身体发育不良，严重肝肾疾病的患儿；对照组为早产儿（胎龄小于37周），生长发育里程碑正常，无发育异常表现的健康婴儿。两组婴儿年龄、出生胎龄、性别比较，差异无统计学意义（P> 0.05），具有可比性。见表1。本研究经南方医科大学珠江医院医学伦理委员会批准，且所有婴儿检测标本均获得其监护人的同意，并且签署相关知情同意书。

表1 两组研究对象年龄、胎龄、性别比较

1.2 主要材料

Trizol RNA提取试剂（美国Invitrogen公司）、RNA逆转录试剂盒（美国promega公司）、焦碳酸二乙酯（DEPC，北京普瑞达生物有限公司）、RT-qPCR试剂盒（广州莱德尔生物科技有限公司）、PCR扩增仪（郑州博邦）、核酸蛋白测定仪（德国Eppendorf）、7500型快速实时荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司ABI）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 两组研究对象均采集静脉血液样本2 ml，用EDTA管抗凝，离心吸取血清，分装于1.5 ml EP管中，-80℃冰箱保存。

1.3.2 应用生物信息学方法进行靶基因预测及信号通路分析 对应用miRNA基因芯片检测筛选出显著差异表达的4个病毒miRNA，采用miRNA靶基因预测软件（miRanda和targetscan）进行靶基因的预测，将两个软件预测的结果整合作为miRNA的候选靶基因。应用Gene Ontology（GO）分析将两个数据库预测的靶基因进行富集和分类，筛选出与感染、炎症、免疫等密切相关的靶基因，并采用Pathway生物学通路分析进行相关信号通路预测。

1.3.3 应用qRT-PCR验证4个病毒miRNA的差异表达 ①试验组及对照组外周血标本进行总RNA提取，进行标本合格性检测；②逆转录：在PCR的扩增仪上，使用逆转录酶进行逆转录，后续进行翻译；③qRT-PCR定量：将逆转录后的标本进行实时PCR反应体系进行反应。

1.4 统计学分析

采用SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验和两独立样本非参数K-S检验进行分析，计量资料采用χ2检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病毒miRNA进行生物信息学分析

2.1.1 靶基因预测 对病毒miRNA（sv40-miRS1-5p、hsv1-miR-H6-5p、hsv2-miR-H10、ebvmiR-BART8-3p）进行靶基因预测。采用miRanda及targetscan两个数据库对筛选出的4个病毒miRNA进行预测，得到靶基因信息进行整合后作为4个病毒miRNA的候选靶基因。

2.1.2 GO分析结果 根据靶基因预测结果，对4个病毒miRNA进行GO分析靶基因富集、分类结果显示，sv40-miR-S1-5p、hsv1-miR-H6-5p和hsv2-miR-H10与炎症、感染和免疫等密切相关，见表2。

表2 GO分析富集的与PVL相关的靶基因数

2.1.3 与PVL相关的靶基因的Pathway生物通路图 4个病毒miRNA经Pathway生物学信息通路分析，预测到其生物学信息通路与炎症、免疫密切相关，包括：丝裂原活化蛋白激酶（mitosolysis activates protein kinase，MAPK）信号转导通路、Toll样受体生物学通路、缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）生物学通路及T细胞相关生物学通路。其中靶基因MyD88、TRAF6、IL1R、TLR6、IFN-αβR、TGFB、ERK、p38等与炎症、免疫相关通路密切相关，位于MAPK和Toll样受体信号通路上游的关键位置（图1～2）。

图1 MAPK相关生物通路图

2.2 实时荧光定量PCR检测验证病毒miRNA差异表达

应 用qRT-PCR检 测sv40-miR-S1-5p、hsv1-miR-H6-5p、hsv2-miR-H10、ebv-miR-BART8-3p4个病毒miRNA（图3）。以miR-425为内参，其中sv40-miR-S1-5p、hsv1-miR-H6-5p、hsv2-miR-H10共3个病毒miRNA的相对表达量与对照组比较，差异有统计学意义（P< 0.05），与miRNA基因芯片结果一致（表3）。

表3 4个病毒miRNA相对表达量统计学分析表（x ± s）

图2 Toll样受体相关生物通路图

图3 病毒miRNA的扩增曲线及溶解曲线图

3 讨论

世界卫生组织统计，全世界每年约有1500万早产儿（每10名活产婴儿中就有1名）出生时间不到37周。早产是五岁以下婴儿死亡的主要原因，每年出生的极低出生体重婴幼儿约占400万活产婴儿的1.5%。尽管早产儿护理方面的持续发展显著改善了极低出生体重儿（<1.5 kg）的生存率，但随着生存率的提高，神经功能障碍、永久性运动障碍（即PVL）见于约10%的早产儿幸存者[5-7]。

miRNA是小的内源性非编码RNA，用于在转录后调节基因表达。miRNA在转录过程中，与相应mRNA结合，从而在蛋白质水平进行调控，影响翻译的效率，进而参与调节机体细胞的众多生理过程。进一步研究表明，miRNA可与RNA病毒的基因组进行结合，从而影响病毒进入宿主后，病毒的复制及所引起相应的病理改变[8]。miRNA在脑损伤方面的研究正在扩大，因为miRNA是基因表达的关键调节因子，也是生物标志物开发有希望的候选者[9]。Cullen等[10-11]研究发现，miRNA在病毒入侵机体后，对机体组织进行选择以及引发相关病症或对组织进行损害均有重要意义。其中包括 EBV、HSV、CMV在内的多种病毒能够编码产生miRNA，进而上调或下调机体体内某些靶基因的水平，影响与病毒感染相关的免疫、炎症因子、信号分子等，从而影响机体的炎性免疫反应。

本研究对既往应用miRNA基因芯片检测PVL早产儿和健康早产儿外周血清中miRNA的表达，筛选出显著差异表达的病毒miRNA进行生物学分析。采用GO分析对预测到的靶基因富集、分类结果显示，4个病毒miRNA（sv40-miR-S1-5p、hsv1-miR-H6-5p、hsv2-miR-H10、ebv-miR-BART8-3p）的靶基因与炎症、感染、免疫等密切相关。应用Pathway生物学信息通路分析，预测密切相关的生物学通路，其中包括Toll样受体生物学信号通路、MAPK信号通路、T细胞受体信号通路及HIF-1信号通路等炎症、免疫相关通路，其中靶基因MyD88、TRAF6、IL1R、TLR6、IFN-αβR、TGFB、ERK、p38等与炎症、免疫相关通路密切相关，处于Toll样受体信号以及MAPK信号通路的关键位置。进一步扩大样本采用qRT-PCR技术检测上述4个病毒miRNA，结果发现sv40-miR-S1-5p、 hsv1-miR-H6-5p、hsv2-miR-H10共3个病毒miRNA的相对表达量与对照组差异有统计学意义，与miRNA基因芯片结果一 致。提 示sv40-miR-S1-5p、hsv1-miR-H6-5p、hsv2-miR-H10在PVL的发病中起重要作用。

hsv1-miR-H6-5p和hsv2-miR-H10是 单 纯疱疹病毒1型（HSV1）和2型（HSV2）分别编码的miRNA，人类是HSV的自然宿主，可累及口腔、皮肤、黏膜、眼黏膜及中枢神经系统[12]。Gibson检测的443例脑瘫患儿和883例健康对照儿童中HSV1、HSV2、EBV、CMV等嗜神经病毒核酸的表达含量，发现脑瘫患儿在围生期高度暴露于上述疱疹病毒和肠道病毒中[3]。特定病毒的感染可能会影响人自身编码的miRNA，上调或下调相关miRNA的表达水平，对病毒的感染进程起促进或抑制的作用。sv40-miR-S1-5p是猿猴空泡病毒40（simian vacuolating virus 40，SV40）编码的miRNA[13]，有研究表明，SV40 对脑组织有亲嗜性，可在人胎脑细胞内繁殖[14]。

Guo K等[15]发现在脂多糖诱导的PVL新生鼠模型中，miRNA在其发病机制中有重要调节作用。该研究使用miRNA微阵列分析检测获得104个与PVL相 关 的miRNA，用qRT-PCR对miRNA微 阵列验证其表达差异，研究表明，PVL模型的miRNA表达谱与对照组相比有显著变化。如miR-451表达升高，而rno-miR-200b表达显著降低，进一步行生物学分析，发现其与炎症反应通路密切相关，表明部分miRNAs在脑组织中存在差异表达，可能参与了发生PVL的分子机制，但其调节的基本机制尚未完全明了。

已有研究表明[16]，围生期胎儿脐带血和羊水组织中的炎症相关细胞因子的水平上升和早产、脑瘫的发生有较高关联性。若脐带血中IL-6>11 pg/ml的早产儿，PVL和脑室内出血的发生率为78%，而脐带血中IL-L的水平< 11 pg/ml，脑损伤的发生率为30%。在PVL脑室周围病灶中，大量炎症细胞因子的活性显著增高[17-18]，提示炎症及感染相关因素在PVL的发病中占有重要位置。

本研究在PVL早产儿外周血中应用miRNA基因芯片检测出显著表达差异的4个病毒miRNA，生物学分析可知，其与炎症相关的靶基因及生物学通路密切相关，并经qRT-PCR进一步验证，sv40-miR-S1-5p、 hsv1-miR-H6-5p和hsv2-miR-H10共3个病毒miRNA存在显著差异表达，与基因芯片结果一致，充分提示了这3个病毒miRNA可能在PVL的发病中产生影响。这些病毒感染可以发生在整个妊娠期，病毒感染后可呈潜伏感染状态，可使母体反复感染，并有在整个妊娠期感染胎儿的能力，甚至在产时、产后感染新生儿。病毒进入机体后，相应病毒编码miRNA表达变化，靶向作用于其靶基因，或调节机体内miRNA的表达水平变化，激活MAPK、Toll样受体生物学信号通路，引起级联反应，使宫内胎儿的炎症因子出现大幅度上调，对胎儿脑组织产生直接或间接的损害，可导致PVL的发生。

外周血检查特异地miRNA表达，有可能成为PVL早期诊断的指标，进一步扩大样本，多中心协作，寻找PVL诊断的可靠指标。