GnRH-a联合HCG双扳机在高龄卵巢储备功能减退患者中的应用

王金玉，张啸龙，张杰平，王雪，张翠莲

(郑州大学人民医院，河南省人民医院，河南省生殖医学工程国际联合实验室，郑州 450003)

随着社会发展及女性生育意愿推迟，高龄不孕症女性逐年增加。高龄是引起卵巢储备功能减退(DOR)的重要因素。高龄DOR患者因卵母细胞数量减少及质量下降，在促排卵治疗中常表现为卵母细胞质量差、获卵少、受精率下降，从而难以获得理想的妊娠结局[1]。高龄DOR患者助孕治疗的关键是提高卵母细胞质量，以期获得更多可利用胚胎。对于接受促排卵治疗的患者，由于垂体受到抑制，临床常通过注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)，模拟体内LH峰，以促进卵母细胞最终成熟，即HCG扳机方案。然而实际在自然生理周期中，触发卵母细胞最终的成熟和排卵是由LH与FSH协同完成，研究显示伴随LH峰出现的FSH 峰可以促进卵泡成熟[2]。应用促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)联合HCG扳机触发排卵，与既往HCG扳机仅模拟LH峰不同，GnRH-a扳机不仅能诱发LH峰，还能诱发FSH峰，更接近生理状态，如果GnRH-a联合标准剂量的HCG扳机，则LH作用更强，同时还伴有内源性FSH峰的出现，更有利于卵母细胞成熟[3]。近年来，越来越多的研究报道相较单纯HCG扳机，采用GnRH-a联合HCG扳机可以显著提高DOR患者行体外受精/卵胞浆内单精子显微注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)周期的获卵数、MⅡ卵数、正常受精(2PN)数、第3天(D3)可利用胚胎数、临床妊娠率，甚至活产率[4-7]。因年龄是临床妊娠率的独立影响因素[8]，所以有一项研究仅纳入了年龄≥35岁DOR患者，其结果显示GnRH-a联合HCG扳机可改善患者IVF冻融胚胎移植周期的临床结局[9]。目前鲜有关于GnRH-a联合HCG扳机是否可以改善≥35岁DOR患者新鲜胚胎移植周期的临床结局的研究报道[10]。本研究通过回顾性分析≥35岁高龄DOR患者行拮抗剂方案促排卵中使用GnRH-a联合HCG扳机的应用效果，以期为改善高龄DOR患者新鲜胚胎移植周期妊娠结局提供更好的扳机方案。

资料和方法

一、研究对象

回顾性分析2016年1月至2021年10月在河南省人民医院生殖医学中心行IVF/ICSI-ET助孕的患者临床资料。

纳入标准：(1)本周期促排卵采用拮抗剂方案；(2)年龄≥35岁；(3)符合DOR诊断标准[11]，即月经第3天(月经紊乱者可于超声检查未见优势卵泡时)窦卵泡计数(AFC)<7个、抗苗勒管激素(AMH)≤1.1 ng/ml、基础促卵泡生成素(bFSH)≥10 U/L，以上3项符合2项。

排除标准：(1)多囊卵巢综合征患者；(2)存在宫腔疾病严重影响子宫内膜环境，包括重度子宫内膜异位症、子宫内膜增生或结核、宫腔积液或重度粘连等；(3)糖尿病、甲亢、高泌乳素血症等内分泌疾病者；(4)其中一方染色体异常。

研究共纳入273个周期，根据扳机方式不同分为双扳机组(GnRH-a联合HCG扳机n=177)和HCG板机组(n=96)。

二、研究方法

1.促排卵方案：两组患者均采用拮抗剂方案促排。月经第2～4天行B超检查和基础性激素测定，如果没有优势化卵泡和功能性卵巢囊肿，使用促性腺激素(Gn)(果纳芬，默克雪兰诺，瑞士；或普丽康，默沙东，美国；或丽申宝，珠海丽珠；或尿促卵泡素，珠海丽珠)150～300 U/d 至扳机日。于促排卵第4天再次B超监测卵泡发育，待B超下见卵泡直径≥12 mm时，加用促性腺激素释放激素拮抗剂(GnRH-ant)(思则凯，默克雪兰诺，美国)0.25 mg/d，皮下注射至扳机日。根据卵泡直径、血清激素水平确定扳机时间，当有2个卵泡直径≥17 mm或1个卵泡直径≥18 mm 时，根据个体情况给予2种不同的扳机方案：(1)双扳机方案：HCG(珠海丽珠)6 000～10 000 U肌肉注射联合GnRH-a(达必佳，辉凌，德国)0.2 mg皮下注射；(2)HCG 扳机方案：HCG 6 000～10 000 U肌肉注射。两组均于扳机后34～36 h取卵。

2.胚胎培养及移植：新鲜周期取卵后，根据男方精液参数进行IVF或ICSI受精。取卵后第3天(D3卵裂期胚胎)评估胚胎质量，结合患者本周期整体情况和患者意愿，选取1～2枚D3可利用胚胎进行新鲜胚胎移植或胚胎玻璃化冷冻保存。

根据卵裂球的数目、大小、形态及碎片量将D3卵裂期胚胎分为Ⅳ级。Ⅰ级：卵裂球大小均匀，形态规则，透明带完整，碎片<10%；Ⅱ级：卵裂球大小略不均匀，形态略不规则，10%≤碎片<25%；Ⅲ级：卵裂球大小不均，形态不规则，25%≤碎片≤50%；Ⅳ级：卵裂球大小严重不均，形态严重不规则，碎片>50%。优质胚胎评判标准：显微镜下观察受精后D3胚胎卵裂球数为6～10个，且卵裂球大小均匀，碎片<25%。故Ⅰ、Ⅱ级为优质胚胎，Ⅲ级为有效胚胎，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级胚胎为可利用胚胎。

3.黄体支持：行新鲜胚胎移植的患者于取卵日开始黄体支持，给予地屈孕酮片(达芙通，苏威，荷兰)10 mg/次口服，3次/d，联合8%黄体酮阴道缓释凝胶(雪诺同，默克雪兰诺，德国)90 mg阴道给药，1次/d。移植14 d后查血β-HCG判断是否妊娠，若血β-HCG<0.1 U/L则为未妊娠，停用黄体支持药物；若0.1 U/L<血HCG<50 U/L，则隔日复查HCG，继续黄体支持，正常情况下继续黄体支持至移植后70 d逐渐减量停药。

4.妊娠结局的判定：根据血β-HCG水平明确妊娠情况，β-HCG≥50 U/L时则为HCG阳性。移植后28 d、35 d行B超检查，B超下可见孕囊及胎心搏动为临床妊娠。妊娠不足12周终止者为早期流产。

5.观察指标：两组患者的一般资料、HCG日E2水平及≥14 mm卵泡数、HCG扳机剂量、获卵数、MⅡ卵数、MⅡ卵率、2PN数、2PN率、D3可用胚胎数、D3可用胚胎率、D3优质胚胎数、D3优质胚胎率、未取到卵母细胞率、无可移植胚胎率、着床率(着床率=孕囊数/移植胚胎数×100%)、HCG阳性率(HCG阳性率=HCG阳性周期数/新鲜胚胎移植周期数×100%)、临床妊娠率(临床妊娠率=临床妊娠周期数/新鲜胚胎移植周期数×100%)、早期流产率(早期流产率=早期流产周期数/临床妊娠周期数×100%)等。

三、统计学分析

结 果

一、两组患者的一般资料

共纳入符合条件的268例高龄DOR患者，共273个周期，双扳机组(n=177)和HCG板机组(n=96)间的患者年龄、体质量指数(BMI)、不孕年限、AMH、AFC、bFSH、Gn天数、Gn总用量、HCG日E2水平、HCG日≥14 mm卵泡数及HCG扳机剂量等比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 两组患者一般资料比较

二、两组患者的促排卵情况

双扳机组的MⅡ卵数、2PN数及D3可用胚胎数均显著高于HCG扳机组(P<0.05)；无可移植胚胎率显著低于HCG扳机组(P<0.05)；两组患者的平均获卵数、MⅡ卵率、2PN率、D3可用胚胎率、D3优质胚胎数、D3优质胚胎率、未取到卵母细胞率及ICSI比例均无显著性差异(P>0.05)，但双扳机组未取到卵母细胞率略低于HCG扳机组(表2)。

表2 两组患者促排卵情况比较

三、两组患者新鲜周期移植的妊娠结局

本研究中双扳机组有74个周期、HCG扳机组有58个周期进行了新鲜周期移植。统计新鲜周期移植的临床妊娠结局，结果显示：双扳机组的HCG阳性率、临床妊娠率显著高于HCG扳机组(P<0.05)；但两组患者的移植胚胎数、移植日内膜厚度、着床率及早期流产率比较均无显著性差异(P>0.05)(表3)。

表3 两组患者新鲜周期移植临床结局比较

四、广义估计方程分析临床妊娠率的影响因素

将分组依据纳入方程，同时纳入年龄、不孕年限、AMH、AFC、HCG日≥14 mm卵泡数等作为协变量，选择自相关来定义同一患者多个周期间数据的关系。结果显示，控制自相关并校正混杂因素后，双扳机方案的使用[OR=2.413，95%CI(1.016，5.728)，P=0.046]是临床妊娠率的保护因素，年龄增加[OR=0.787，95%CI(0.694，0.893)，P<0.001]是临床妊娠率的危险因素(表4)。

表4 广义估计方程多因素分析结果

讨 论

高龄DOR患者因卵巢AFC数减少，导致卵巢低反应，因此如何提高卵母细胞质量并获取更多可利用胚胎成为治疗该类患者的研究热点。GnRH-a+HCG双扳机方案可在一定程度上提高DOR患者IVF/ICSI周期的卵母细胞质量及胚胎质量，进而改善临床结局。Zhang等[6]回顾性队列研究纳入卵巢低反应患者共714个IVF-ET周期，但未限制年龄，其结果表示双扳机组[平均年龄(36.31±4.37)岁]的获卵数、获卵率、MⅡ卵数及MⅡ卵率均显著高于HCG扳机组[平均年龄(35.95±4.47)岁]，但冻融胚胎移植周期中两组临床妊娠率无显著差异。众所周知，年龄是影响卵母细胞数量及质量的重要因素，也是临床妊娠率的独立影响因素[8]。Chern等[9]研究中纳入了≥35岁的高龄DOR患者共384个IVF-ET周期，结果显示双扳机组的获卵数、MⅡ卵数、2PN数、D3可用胚胎数和D3优质胚胎数均显著高于HCG扳机组，在冻融胚胎移植周期中双扳机组[平均年龄(40.0±2.7)岁]的临床妊娠率和活产率也均显著高于HCG扳机组[平均年龄(40.0±2.8)岁]。但Xiao[10]提出冻融胚胎移植周期妊娠结局的影响因素更多是胚胎质量及子宫内膜准备情况，扳机药物的作用可能较小，并建议比较双扳机组与HCG扳机组的新鲜胚胎移植周期妊娠结局。另外，有研究报道GnRH-ant促排卵周期注射HCG联合GnRH-a扳机可以改善卵巢正常反应者新鲜胚胎移植周期的妊娠结局，他们推测GnRH-a与GnRH受体(GnRHR)的亲和力比GnRH-ant强，GnRH-a可以从子宫内膜的GnRHR中置换出GnRH-ant，从而激活之前被GnRH-ant抑制的GnRHR，继而调控HCG分泌，建立“母胎对话”通路，改善子宫内膜容受性，为胚胎着床创造有利条件[12-13]。因此本研究纳入采用GnRH-ant方案促排卵且年龄≥35岁高龄DOR患者的IVF/ICSI-ET周期，旨在探索双扳机方案能否提高此类患者的获卵参数及改善新鲜胚胎移植周期妊娠结局。

本研究结果显示，双扳机组的MⅡ卵数、2PN数及D3可用胚胎数均显著高于HCG扳机组，无可移植胚胎率显著低于HCG扳机组，与既往Chern等[9]研究结果一致。且本研究表示双扳机组新鲜胚胎移植周期的HCG阳性率和临床妊娠率均显著高于HCG扳机组。GEE校正了年龄、AMH、AFC等混杂因素的结果显示，双扳机方案的使用[OR=2.413，95%CI(1.016，5.728)，P=0.046]是临床妊娠率的保护因素，年龄增加[OR=0.787，95%CI(0.694，0.893)，P<0.001]是临床妊娠率的危险因素。上述研究结果提示双扳机方案有利于改善高龄DOR患者卵母细胞质量、受精情况，提高D3可利用胚胎数、降低无可移植胚胎率。

实际上在生理周期中，卵母细胞最终成熟就是在内源性LH峰协同FSH峰的作用下完成的。一方面，LH峰可诱导卵母细胞减数分裂为次级卵母细胞，并促进相关促排卵物质释放，使卵丘和卵巢颗粒细胞分离，是卵母细胞成熟及排卵的必要条件[9]。尽管注射HCG可以模拟LH结合LH/HCG受体(LHCGR)，触发卵母细胞成熟，但因HCG和LH与LHCGR的亲和力和半衰期不同，HCG在部分情况下不能诱导卵母细胞减数分裂并完成卵母细胞生发泡破裂，最终导致部分卵母细胞不成熟，或者卵母细胞细胞质与细胞核成熟度不同步，引起受精率降低，甚至无可用胚胎[5，14]。GnRH-a生物学特性是天然GnRH的50～100倍，GnRH-a可激发垂体的点火效应，诱发更加接近生理水平的LH峰[15]。虽然GnRH-a扳机触发的内源性LH峰的时间较短、峰值较低，但双扳机方案中联合标准剂量HCG扳机模拟LH峰可以弥补这一缺陷，因此双扳机方案在LH峰方面的双重作用有助于卵母细胞成熟，提高卵母细胞及胚胎质量[12]。GnRH-a激活LHCGR能力较弱，会导致新鲜胚胎移植周期黄体功能不足，但双扳机方案在GnRH-a诱发排卵同时添加标准剂量HCG可以补救黄体功能不足并改善新鲜胚胎移植周期妊娠结局[16]。另一方面，GnRH-a诱发的内源性FSH峰在促进卵母细胞成熟及排卵中也发挥着重要作用。既往研究比较了双扳机组与HCG扳机组卵巢颗粒细胞中相关基因的表达水平，包括与FSH水平直接相关的基因[表皮调节素(Ereg)、双调蛋白(Areg)及通道蛋白43]，结果显示FSH可以上调Ereg、Areg的mRNA表达，有助于提高人GV期卵母细胞的成熟率，介导FSH参与卵丘扩张和卵母细胞成熟[9，16-18]。双扳机方案触发的FSH峰还可以下调通道蛋白43的mRNA表达，有利于卵母细胞发育[16，19]。因此，双扳机方案利用GnRH-a触发内源性FSH峰，既可增加颗粒细胞中Ereg、Areg的表达，又降低了通道蛋白43的表达，提高了卵母细胞及胚胎质量[16]，本研究的实验结果可能也与此相关。

综上所述，在高龄DOR患者的拮抗剂方案促排卵周期中，GnRH-a联合HCG扳机方案较单纯HCG扳机方案可以显著提高MⅡ卵数、2PN数、D3可用胚胎数及新鲜移植周期的临床妊娠率，经GEE校正年龄、AMH、AFC等混杂因素后，双扳机方案仍是临床妊娠率的保护因素。因此，在临床中，对于高龄DOR患者可尝试用GnRH-a联合HCG的双扳机方案，但由于本文为回顾性研究且样本量较小，实验结果尚需要更大样本量的随机对照研究加以证实。