气相色谱-离子迁移谱结合化学计量学分析成熟时间对牦牛乳干酪挥发性风味物质的影响

刘瑶，乔海军*，贾志龙*，张卫兵，张春艳，霍尚蕾，苗景源，申梦娜

1(甘肃农业大学 理学院，甘肃 兰州，730070)2(甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州，730070) 3(山东海能科学仪器有限公司，山东 济南，250000)

近年来，随着生活水平的提高，人们不仅追求高营养价值的乳制品，而且也越来越注重其风味品质[1]。干酪(奶酪)被誉为“奶黄金”，因其富含蛋白质、钙等营养物质，成为人类摄入乳制品的最佳选择，而广受消费者青睐。干酪的风味是消费者嗜好性选择和决定其品质的重要指标[2]，其风味特征在很大程度上是由挥发性风味物质决定的，它们主要由原料乳中的风味物质及加工过程中乳成分在酶及微生物代谢时产生[3]。牦牛乳干酪(yak milk cheese, YMC)是以新鲜牦牛乳为原料，经添加发酵剂和凝乳酶凝乳制得的新鲜或发酵成熟的乳制品。YMC营养丰富、成熟期较长，且具有独特的风味特征[4]。因此，系统研究YMC成熟过程中挥发性风味物质组成及差异，确定其特征挥发性风味化合物，对YMC产品的开发和风味品质的控制具有重要意义。

目前，关于YMC风味物质的研究报道相对较少，且不够系统深入。如牛婕等[5]采用同时蒸馏萃取结合气相色谱-质谱联用技术从牦牛乳软质干酪中共鉴定出46种挥发性风味化合物。王宠等[6]采用固相微萃取结合GC-MS技术从牦牛乳硬质干酪中共鉴定出32种挥发性成分，其中丁酸、异戊醇、甲酸甲酯、乙酸、正己酸和乙酸乙酯为主要挥发性成分。巨玉佳等[7]通过电子鼻技术辅助GC-MS分析认为己酸和2-丁醇是牦牛乳硬质干酪关键香气物质。虽然GC-MS技术已广泛用于食品挥发性风味物质分析，但存在无法快速检测、低含量组分定性不准确、需要复杂的预处理等缺点[8]。气相-离子迁移谱(gas chromatography-ion mobility spectrometry, GC-IMS)技术结合了气相色谱(GC)高分离能力和离子迁移谱(IMS)快速响应的特点，且具有灵敏度高、响应快、无需预处理、稳定性好、可常压下工作等优点[9]，目前已被大量用于食品分类及挥发性风味物质指纹图谱的建立[10]、食品新鲜度和变质评估[11]以及检测食品储存过程中挥发性成分的变化[12]等方面。然而，GC-IMS技术用于发酵乳制品挥发性风味成分的检测鲜见报道，将其用于YMC挥发性风味化合物的分析尚未报道。

本研究以自制YMC为研究对象，采用GC-IMS技术建立不同成熟阶段YMC的指纹图谱，结合偏最小二乘-判别分析(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)、主成分分析(principal component analysis, PCA)和热图分析，解析YMC成熟过程中挥发性组分及差异，并筛选潜在特征挥发性化合物，以期探明不同成熟阶段YMC挥发性风味物质的变化规律，为进一步阐明其特征挥发性风味化合物的代谢机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜牦牛乳，甘肃省天祝藏族自治县红疙瘩牧场(夏季牧场)；发酵剂(保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌)，丹尼斯克(中国)有限公司；凝乳酶(小牛皱胃酶和牛胃蛋白酶质量比为7∶3，酶活力890 IMCU/g)，北京多爱特生物科技有限公司；正构酮类C4～C9(2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮和2-壬酮)(分析纯)，北京国药集团化学试剂有限公司；NaCl、无水CaCl2、无水Na2SO4(均为分析纯)，天津市北辰方正试剂厂。

1.2 仪器与设备

FlavourSpecc®风味分析仪，德国G.A.S公司；PR224ZH/E析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；XH-C旋涡混合器，金坛区白塔新宝仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

参考王宠等[6]的方法并适当修改。新鲜牦牛乳通过63 ℃巴氏杀菌30 min后冷却至室温，添加质量浓度为0.006 2 g/L已活化的发酵剂发酵1 h，测其pH值为6.2时，添加质量浓度为0.03 g/L的CaCl2，并加入质量浓度为0.50 g/L的小牛皱胃酶溶液凝乳80 min，经切割、排乳清后，再加入凝块质量2%的NaCl，并在42 ℃加热20 min后二次排乳清，堆酿30 min装入模具压榨成型，真空包装后置于人工气候箱，15 ℃条件下分别成熟1、30、60、90、120、150、180 d。

1.3.2 牦牛乳干酪成熟过程中挥发性风味成分分析

准确称取3.00 g YMC样品和3.00 g NaCl，放入研钵研匀后，加入20 mL顶空瓶密封，进行GC-IMS分析，每个样品平行3次。

顶空进样条件：孵育温度80 ℃；孵育时间20 min；进样针温度85 ℃；进样体积200 μL。

GC条件：色谱柱：MXT-5(15 m×0.53 mm×1.0 μm)；柱温60 ℃；初始流速2 mL/min，保持2 min；10 min内线性升至10 mL/min，不保持；20 min内线性升至100 mL/min，保持10 min。

IMS条件：漂移气流量150 mL/min；载气/漂移气：N2(纯度≥99.999%)；载气流量0～2 min，2 mL/min；IMS温度45 ℃。

1.4 统计分析

利用仪器配套的分析软件VOCal、GC×IMS Library Search和内置插件(Reporter、Gallery Plot和Dynamic PCA插件)进行数据采集和分析。应用Library Search软件内置的NIST和IMS数据库进行定性分析；利用Reporter和Gallery Plot插件对比指纹图谱的差异；利用Dynamic PCA插件进行聚类分析。采用SIMCA-P14.1软件进行PLS-DA建模分析。采用origin 2018进行统计分析及制图。

2 结果与分析

2.1 不同成熟阶段牦牛乳干酪GC-IMS挥发性风味物质差异分析

由Reporter插件生成不同成熟阶段YMC挥发性风味物质的GC-IMS三维谱图，由图1所示，其中X轴为迁移时间，Y轴为保留时间，Z轴为峰强度[9]。成熟1 d时YMC的挥发性风味物质种类最少；成熟30～90 d时挥发性风味物质种类相似，但信号强度有所不同；成熟120～180 d时挥发性风味物质明显多于成熟1～90 d时的YMC样品；不同成熟阶段YMC的挥发性风味物质差异较大。

图2-a是不同成熟阶段YMC挥发性风味物质的GC-IMS二维谱图。不同成熟阶段样品间挥发性风味物质的差异主要体现在离子峰的位置、数量、强度和时间上。背景为蓝色，横坐标1.0处红色竖线为反应离子峰(reaction ion peak, RIP)。RIP峰两侧的每1个点代表1种挥发性风味化合物，颜色代表物质的信号强度。白色表示低强度，红色表示高强度，颜色越深，强度越大[9]。为了更加清晰地比较样品之间的差异，采用差异对比模式，结果见图2-b。通过从二维俯视图(以15-CR-1 d为背景)中扣除背景，得到样品挥发性风味物质的变化差异图，扣除背景后为白色，红色表示物质浓度高于参考值，蓝色表示物质浓度低于参考值[9]。从图2-b可以更加直观看出，大多数红色信号(图2-b中红色框区域)出现在100～600 s的停留时间范围内，漂移时间为1.0～1.5 ms；成熟120～180 d时，漂移时间迅速增加至1.8 ms；此外，图2-b红框中红色点的数量明显增加，且红色点的颜色逐渐加深，这表明随着成熟时间的延长，挥发性风味物质在逐渐积累，这与程晶晶等[13]的研究结果相似。

2.2 不同成熟阶段牦牛乳干酪GC-IMS挥发性风味物质定性分析

采用FlavourSpec®GC-IMS内置的NIST和IMS数据库，结合保留指数、保留时间和迁移时间，以正构酮类作为外标物计算每种挥发性物质的保留指数，进行化合物定性分析[14]，不同成熟阶段YMC的挥发性风味物质定性分析结果见表1(其中部分化合物以单体和二聚体形态存在)。

a-二维俯视图；b-差异图谱图2 不同成熟阶段YMC的GC-IMS二维谱图Fig.2 Two dimensional GC-IMS spectra of YMC at different ripening stages

表1 不同成熟阶段牦牛乳干酪中挥发性化合物定性鉴定结果Table 1 Qualitative identification results of volatile compounds of YMC at different ripening stages

由表1可知，从检测到的46个信号峰中，共鉴定了22种挥发性风味化合物，包括8种酯类、5种酮类、4种醇类、3种醛类、1种吡啶类和1种其他类。其中酯类包括乙酸乙酯二聚体、己酸乙酯二聚体、丙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸异戊酯、2-甲基丁酸乙酯和辛酸乙酯，MOLIMARD等[15]认为酯类物质是由干酪成熟过程中脂肪酸与乳糖发酵产生的醇类酯化反应产生，它们为YMC贡献了浓郁果香味；酮类包括乙偶姻、2-庚酮二聚体、2-丁酮、2-戊酮二聚体和双乙酰，它们主要由不饱和脂肪酸氧化产生[16]，为YMC提供了奶油香味和辛辣味；醇类包括乙醇、正丁醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇和正己醇，主要来源于乳糖代谢、甲基酮还原、氨基酸代谢和亚油酸、亚麻酸降解等[17]，赋予了YMC辛辣味、酒香、嫩枝气息和脂香味；醛类包括异戊醛二聚体、正戊醛、苯甲醛，脂肪酸代谢或Strecker降解可能是醛类化合物的主要来源[18]，为YMC提供了苹果味和杏仁味；而2,4,6,-三甲基吡啶和烯丙基腈为YMC贡献了芳香味和大葱味。这些挥发性物质共同构建了YMC独特的风味。

2.3 不同成熟阶段牦牛乳干酪挥发性风味物质指纹图谱

为解析不同成熟阶段YMC挥发性风味化合物的差异性，根据GC-IMS二维图谱中全部信号峰，构建了不同成熟阶段YMC挥发性风味化合物指纹图谱，如图3所示，并标识了不同成熟阶段的特征峰区域。横坐标表示所检测到的挥发性风味化合物，纵坐标表示不同成熟阶段，每一行代表1个成熟阶段所选全部信号峰的3次平行，每一列代表不同成熟阶段检测到的YMC挥发性风味化合物信号峰(颜色越深，反应该物质的含量较高)。横坐标中阿拉伯数字表示的化合物未被定性，不作分析。

从指纹图谱(图3)可以看出不同成熟阶段YMC样品中挥发性风味物质组成及差异。为了方便观察比较，将其分为5个区域(图3)，分别为A、B、C、D、E。图中A区域为成熟1 d时YMC的挥发性风味物质，在成熟过程中含量逐渐降低，主要有乙偶姻、乙醇、戊醛和2-庚酮二聚体，而戊醛的浓度在成熟60 d时有所提升。图中B区域物质(3-甲基-3-丁烯-1-醇)代表成熟30 d时YMC的挥发性风味物质，其浓度远大于其他成熟阶段样品，并为YMC提供了清香味和青草味，这与GARDE等[19]研究结果一致。图中C区域物质(乳酸乙酯、烯丙基腈和双乙酰)代表成熟60 d时YMC的挥发性风味物质。图中D区域物质显示了成熟120 d时YMC的挥发性风味物质，主要有丙酸乙酯、异戊醛二聚体、己酸乙酯二聚体、2-丁酮、2-甲基丁酸乙酯、辛酸乙酯和2,4,6-三甲基吡啶，且在成熟过程中浓度先升高后降低。图中E区域物质(丁酸乙酯、乙酸异戊酯、1-丁醇、苯甲醛、1-己醇、2-戊酮二聚体和乙酸乙酯二聚体)代表成熟180 d时YMC的挥发性风味物质，其在整个成熟过程中的峰颜色明显较深，表明这些物质的含量高于其他成熟阶段YMC的样品，而乙酸乙酯、丁酸乙酯和2-戊酮等，与巨玉佳等[7]报道的牦牛乳硬质干酪中挥发性风味物质的研究结果一致。此外，在成熟过程中，乙偶姻、戊醛、3-甲基-3-丁烯-1-醇、乳酸乙酯、烯丙基腈、双乙酰、丙酸乙酯、异戊醛和2,4,6-三甲基吡啶，在牛婕等[5]从牦牛乳软质干酪鉴定出32种挥发性成分中未见报道。

图3 不同成熟阶段YMC中挥发性有机物的指纹图谱Fig.3 Gallery fingerprint of volatile organic compounds of YMC at different ripening stages

从YMC不同成熟阶段挥发性风味物质的相对含量柱状图(图4)可进一步看出，YMC中挥发性成分以酮类(31%～66%)、酯类(8%～45%)和醇类(8%～20%)为主，其次是醛类(3%～9%)和吡啶类(1%～8%)。成熟1 d的YMC中挥发性风味物质主要是酮类、醇类、醛类和酯类。成熟30～60 d时酮类、醛类、醇类含量逐渐降低，当成熟90 d时，酮类化合物含量有所增加，这可能是由于干酪中脂肪酸含量显著降低，部分脂肪酸在微生物作用下转变为甲基酮[20]而导致的，这与牛婕等[5]研究结果一致；醛类容易被氧化成酸类或者还原为醇类[17]；醇类与脂肪酸发生酯化反应形成酯类物质[15]，这可能是导致醇类含量降低而酯类含量有所上升的主要原因。此外，随着成熟时间的延长，酯类逐渐积累，在很大程度上，酯类可以掩盖因脂肪酸类化合物浓度过高所带来的不愉快的味道，从而赋予干酪更加柔和的风味[21]。

图4 YMC成熟过程中挥发性组分相对含量变化Fig.4 The changes of relative contents of volatile components during the ripening of YMC

2.4 不同成熟阶段牦牛乳干酪中挥发性风味物质PLS-DA及模型验证

PLS-DA是一种将数据进行降维，实现复杂数据的可视化及判别分析和预测[22]。利用PLS-DA得分图对不同成熟时间的YMC挥发性风味物质进行分析，结果如图5-a所示。随机改变分类变量的排列顺序建立相应的模型，R2X=0.995，R2Y=0.996，当R2和Q2处于0.5～1时，表明模型有较好的概括解释率，Q2=0.99表示模型有较好的预测能力。当模型的稳定性和预测能力都比较好时，说明构建的模型稳定性及预测能力均达到要求，可用于区分不同成熟时间YMC中挥发性风味物质组成的差异。

利用置换检验对PLS-DA所做的模型进行验证，在PLS-DA中使用7倍交叉验证预测残差(CV-ANOVA)方差分析和200次顺序上的置换重新得出评价模型的性能指标结果如图5-b所示。图中Q2代表累计交叉预测能力，数值与模型预测能力成正比关系；R2代表累计方差值，表示有多少原始数据被用来建立新的PLS-DA判别模型，数值越大则表示模型的解释能力越强[23]。其中，R2X=0.995，R2Y=0.996，Q2=0.990，R2X-R2Y<0.3，则表明所建模型拟合效果可靠。从图5-b可以看出，R2与左边纵轴相交(0，0.247)，Q2与左边纵轴相交(0，-0.68)，2条回归线斜率较大，且所有的R2和Q2原始值均高于试验值，这表明该模型具有较好预测能力，无过拟合现象，可用于不同成熟阶段YMC挥发性风味物质的分类判别。

依据PLS-DA模型中的变量重要性(variable important for the projection, VIP)将每个变量对YMC风味的贡献进一步量化(图5-c)，筛选VIP>1的挥发性风味化合物作为潜在特征挥发性标志物[24](VIP值越大，差异越显著)。从图5-c中可看出共筛选了12种VIP>1的潜在特征挥发性标志物，分别是3-甲基-3-丁烯-1-醇、乙酸乙酯二聚体、乙偶姻、乙酸异戊酯、乙醇、丁酸乙酯、2-丁酮、正丁醇、己酸乙酯二聚体、烯丙基腈、2-戊酮和苯甲醛。

a-得分图；b-PLS-DA拟合曲线；c-VIP值分布图5 不同成熟时间YMC中挥发性有机物的得分图、 PLS-DA拟合曲线及VIP值分布Fig.5 Score plot,PLS-DA simulation and VIP distribution of YMC volatile components at different ripening stages

2.5 不同成熟时间牦牛乳干酪特征挥发性风味物质聚类分析

通过PCA可直观地判别区分YMC样品间的差异。从图6-a不同成熟阶段YMC主成分分析结果可以看出，PC1(53.00%)和PC2(17.00%)的累积方差贡献率为70.00%，这表明PCA分离模型是有效的[25]。与成熟30～180 d的样品相比，成熟1 d的样品相距较远，样品间组分差异最大，成熟30～90 d的YMC样品分布在同一象限，距离较近，说明它们之间组分差异较小，成熟120～180 d的YMC样品彼此接近，都分布在第一象限，这表明样品间挥发性风味组分差异较小。显然，每个样本都可以区分于其他样本，基于PCA分析结果能较好地区分YMC的不同成熟阶段。

a-主成分分析；b-聚类热图图6 不同成熟阶段YMC特征挥发性物质 主成分及聚类热图分析Fig.6 PCA and clustering heat map of characteristic volatile organic compounds of YMC at different ripening stages

为了直观区分不同成熟阶段YMC特征挥发性化合物的变化，依据筛选出的12种特征挥发性标志物的峰强度值绘制热图(图6-b)。从图6-b聚类热图的凝聚层级聚类分析结果可以看出，YMC的成熟阶段分为3个时期，分别为成熟前期(1 d)、成熟中期(30、60、90 d)和成熟后期(120、150、180 d)。YMC特征挥发性风味化合物在不同成熟时期存在明显差异，在YMC成熟前期，2-戊酮二聚体、苯甲醛、乙偶姻和乙醇含量相对较高，其中乙醇在成熟前期含量最高，且随着成熟时间的延长而降低；成熟中期YMC样品挥发性风味物质种类较少，其中烯丙基腈和3-甲基-3-丁烯-1-醇在成熟中期含量最高，成熟后期随之降低；成熟后期YMC挥发性风味物质的种类较多，其中正丁醇、丁酸乙酯、2-戊酮二聚体、2-丁酮、己酸乙酯二聚体、苯甲醛和乙酸异戊酯含量最高，因此它们是YMC成熟后期的特征挥发性标志物。

3 结论

本研究采用GC-IMS技术对YMC成熟过程中挥发性风味化合物的变化进行了分析，从46个信号峰中共鉴定出22种挥发性风味物质，包括4种醇类、5种酮类、3种醛类、8种酯类、1种吡啶和1种其他。不同成熟时间YMC中挥发性风味物质的含量存在明显差异，成熟前期(1 d)乙醇含量最高；成熟中期(30、60、90 d)，烯丙基腈和3-甲基-3-丁烯-1-醇含量最高，且随着成熟时间延长含量呈递减趋势；成熟后期(120、150、180 d)正丁醇、丁酸乙酯、2-戊酮二聚体、2-丁酮、己酸乙酯二聚体、苯甲醛和乙酸异戊酯含量最高。PLS-DA和热图分析结果共筛选出了12种潜在特征挥发性标志物(VIP>1)，包括3-甲基-3-丁烯-1-醇、乙酸乙酯二聚体、乙偶姻、乙酸异戊酯、乙醇、丁酸乙酯、2-丁酮、正丁醇、己酸乙酯二聚体、烯丙基腈、2-戊酮和苯甲醛。主成分分析结果表明，能较好区分不同成熟时间的YMC样品。研究结果可为YMC产品的开发和风味品质的控制提供依据，并为进一步阐明其特征挥发性风味化合物的代谢机理奠定基础。