温箱和水浴加热法中和新城疫病毒、传染性支气管炎病毒的效果比较

胡江锋 张小娟 胡春艳 白剑英

（1.杨凌绿方生物工程有限公司，陕西西安 712100；2.陕西省兽用生物制品工程技术研究中心，陕西西安 712100；3.陕西诺威利华生物科技有限公司，陕西西安 712100）

鸡新城疫（ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的一种急性、高度接触性传染病，主要侵害鸡和火鸡，其他禽类和野禽也能感染，亦可感染人。该病该病常引起败血症，其特征是呼吸困难、下痢和神经症状，死亡率高，可造成巨大的经济损失[1]。该病是鸡病中危害最严重的一种疫病，世界动物卫生组织（OIE）将该病列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病[2]。鸡传染性支气管炎（IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种急性、高度接触性呼吸道疾病，各鸡龄均易感，雏鸡以喘气为突出症状，产蛋鸡蛋产量和品质下降，是目前危害我国养鸡业发展的主要疫病之一[1]。

随着我国养禽业的迅速发展，特别是集约化、规模化养殖的兴起，如何防控鸡新城疫和鸡传染性支气管炎尤为重要。动物疫病防控的主要环节是消灭传染源、切断传播途径和保护易感畜禽，疫苗免疫是保护畜禽健康的重要措施[3]。免疫效果受疫苗质量的影响较大，而衡量疫苗质量是根据检验结果判定的。我国生产的疫苗有活疫苗和灭活疫苗两大类，活疫苗用在鸡群前期的基础免疫，灭活疫苗用在鸡群后期的加强免疫。目前，预防以上两种疫病的基础免疫常采用“鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗”，疫苗效力检验参照《鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗制造及检验规程》（以下简称 《规程》），具体是将疫苗先进行适当稀释，再分别与相应的阳性血清等量混合，室温中和1h，之后继续稀释，取3 个适宜稀释度分别尿囊腔接种10 日龄健康敏感鸡胚5 枚，0.1mL/胚，37℃孵育观察或测定是否感染，计算EID50，据标准判定疫苗效力合格与否[4]。我国室温规定为10～30℃[5]，在“鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗” 效力检验时，疫苗中的病毒与阳性血清的具体中和温度及采用何种中和方法在《规程》 中尚未明确规定。本实验从中和的方法及温度方面进行探究，以明确中和条件，指导“鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗” 效力检验的实际操作。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗

鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗(LaSota 株+H120株)，以下简称疫苗1，批号：20210503，规格：1000 羽；鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗(LaSota 株+H52 株)，以下简称疫苗2，批号：20210502，规格：1000 羽。均为杨凌绿方生物工程有限公司生产。

1.1.2 阳性血清

鸡新城疫阳性血清，S0 121812；鸡传染性支气管炎阳性血清，S0021501。均购自中国兽医药品监察所。

1.1.3 SPF 鸡胚

SPF 鸡蛋购自济南赛福实验动物养殖有限公司，经杨凌绿方生物工程有限公司前孵化班孵化提供。

1.1.4 主要试剂

生理盐水、PBS（0.1mol/L，pH 7.0～7.2）、1%鸡红细胞悬液，由陕西省兽用生物制品工程技术研究中心提供。

1.1.5 主要设备

孵化机，北京市西山孵化设备厂；电热恒温水浴锅，上海福玛实验设备有限公司；电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；微量振荡器，金坛市正基仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 疫苗中NDV 的中和效果

按《规程》 将疫苗1 和疫苗2 用生理盐水分别稀释至1 羽份/0.5mL，分别装入10 支试管中，1mL/管，每管再加入等量鸡新城疫阳性血清。分别置于10、15、20、25、30℃的恒温培养箱和恒温水浴锅各1 支中和1h（中间摇1 次），此时疫苗为0.1 羽份/0.1mL，即10-1。取出试管继续10 倍梯度稀释，取10-1～10-4各稀释度的稀释液，分别尿囊腔内接种10 日龄SPF 鸡胚5 枚，每胚0.1mL。置37℃孵育144h，弃去24h 前的死亡鸡胚，取出24～144h 死胚，孵育结束时查看鸡胚有无鸡新城疫病毒所致病变，并按红细胞凝集试验法测定鸡胚液的血凝结（即HA）[7]，综合判定疫苗中鸡新城疫病毒被中和的程度，组别中的鸡胚若无鸡新城疫病毒所致病变及HA 阴性，说明疫苗中鸡新城疫病毒被完全中和，否则说明鸡新城疫病毒未被完全中和。根据接种后24～144h 死胚及144h 时存活的鸡胚中出现失水、蜷缩、发育小（接种胎儿比对照最轻胎儿重量低2g 以上）等特异性病变鸡胚的总和按Reed-Muench 法计算疫苗中传染性支气管炎病毒的EID50[6]。

1.2.2 疫苗中IBV 的中和效果

按《规程》 将疫苗1 和疫苗2 用生理盐水分别稀释至1 羽份/0.5mL，分别装入10 支试管中，1mL/管，每管再加入等量鸡传染性支气管炎阳性血清。分别置于10、15、20、25、30℃的恒温培养箱和恒温水浴锅各1 支中和1h（中间摇1 次），此时疫苗为0.1 羽份/0.1mL，即10-1。取出试管继续10 倍梯度稀释，取10-1～10-7各稀释度的稀释液，分别尿囊腔内接种10 日龄SPF 鸡胚5 枚，每胚0.1mL。置37℃孵育120h，弃去接种后48h 内死亡的鸡胚，随时取出48～120h 内死亡的鸡胚，收获鸡胚液，同稀释度等量混合，至120h 取出活胚，逐个收获鸡胚液，收获时查看鸡胚有无鸡传染性支气管炎病毒所致死亡情况及活胚是否有出现失水、蜷缩、发育小（接种胎儿比对照最轻胎儿重量低2g 以上）病变情况，综合判定传染性支气管炎病毒被中和的程度，组别中的鸡胚若无鸡传染性支气管液病毒所致病变，说明疫苗中的传染性支气管液病毒被完全中和，否则说明传染性支气管炎病毒未被完全中和。对收获的鸡胚液按红细胞凝集试验法分别测定红细胞凝集价，1:160（微量法1:128）以上判为感染[7]，按Reed-Muench 法计算疫苗中新城疫病毒的EID50[6]。

2 结果与分析

表1 和表2 为疫苗1 和疫苗2 分别采用温箱和水浴两种方法进行鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒中和试验的结果。从表1 和表2 可看出，不论是疫苗1 还是疫苗2，在效力检验项的病毒中和时间1h 不变的情况下，NDV 和IBV 在与对应的阳性血清等量混合后，在20℃以下水浴法和25℃以下温箱法中和，病毒均不能被对应的阳性血清完全中和，造成对预测另一种病毒的增殖干扰，而且温度越低影响越大，与资料陈述的大多数病毒对热的抵抗力不强，相反，低温对病毒具有较好的保护作用观点一致[8]；25℃水浴法能使病毒被对应阳性血清完全中和，而25℃的温箱法却不能完全中和病毒，这是由于水的导热系数比空气的导热系数大20 多倍，病毒与阳性血清的中和样在相同温度的水里比空气里能较快达到目的温度，一定时间内，病毒与对应阳性血清采用水浴法比温箱法中和较完全；病毒和阳性血清在30℃中和时，2 种方法均能达到病毒被对应阳性血清完全中和，但30℃中和却对另一种病毒造成伤害，这是由于热能可促使病毒新陈代谢，自然环境中（不在宿主细胞内）经过一定时间使其失活。综上，由于NDV 和IBV存在相互干扰增殖的拮抗特性，为保证“鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗” 效力检验项病毒测定结果的真实性，必须在达到一种病毒完全被中和的条件下，再测定另一种病毒含量，且还需考虑过高的中和温度对欲测病毒的影响或伤害。

表1 疫苗中NDV 中和后测得IBV 的EID50

表2 疫苗中IBV 中和后测得NDV 的EID50

3 结论与讨论

在集约化规模化养禽中，若忽视预防优先措施，会使养禽业完全陷于被动局面。家禽防疫着眼点应是使整个群体具有较高的健康水平，而疫苗免疫是提高机体抵抗疫病的有力保障。高质量的疫苗是防疫的基础，判定疫苗质量需依靠检验数值，因而，疫苗质量检验数值的真实性尤为重要。根据试验结果，作者认为在进行“鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗” 效力检验项病毒中和时，中和条件以25℃水浴法中和1h 较为合适，这样不但能达到病毒完全被中和的目的，也避免了中和温度过高而影响病毒含量测定结果的准确性，保证了疫苗检验结果的真实可靠。病毒中和效果受病毒含量、阳性血清中和效价、中和温度、中和时间、中和方法等因素影响，是否受《规程》 规定的时间和温度限制还需进一步研究。