FOXO3和IL-2在干眼患者结膜上皮细胞及泪液中表达及意义

徐 艳， 唐晓蕾， 韩双羽， 刘雪莲

作者单位：(621000)中国四川省绵阳市，四川中医药高等专科学校1眼耳鼻咽喉科教研室；3内科学教研室；2(621000)中国四川省绵阳市中心医院眼科

0引言

干眼(dry eye，DE)是眼科常见的一种疾病，主要是由于泪液质量下降和动力学异常变化而导致的眼表损伤，该疾病与患者的性别和年龄有密切的关联，多发于女性和中老年人[1]。据统计，我国DE的发病率高达21%～30%，且有逐年增长的趋势，严重影响患者的生活质量[2]。近年来，DE的发病机制逐渐引起眼科医师的重视，但目前缺乏有效的诊治标志物，因此，寻找与DE发生发展有密切关系的生物指标是十分有意义的。

叉头框蛋白O3(forkhead box class O3，FOXO3)是FOXO家族中4大亚家族成员之一，其位于细胞质中，在多种器官中都有分布，包括眼、心、胃等，参与调控氧化应激、细胞增殖、分化、凋亡等重要生理过程[3]。白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)是一种多向性的炎性因子，参与机体的多种生理反应，过表达的IL-2可促进炎症发展[4]。IL-2在多种炎症疾病中发挥重要作用，例如糖尿病[5]、结肠炎[6]等，另有研究发现，白内障患者眼内液中IL-2水平显著升高[7]。有研究表明，机体的氧化应激能够激发炎症反应的进程，二者在炎性疾病中具有协同作用[8]。因此，本研究通过探究FOXO3、IL-2在DE患者结膜上皮细胞及泪液中的表达及意义，旨在为明确DE的发病机制提供参考依据。

1对象和方法

1.1对象前瞻性研究。选取2019-03/2021-03我院收治的DE患者106例。纳入标准：(1)DE患者符合干眼的诊断标准[9]；(2)患者均自愿签署知情同意书；(3)未合并眼部其他疾病。排除标准：(1)合并其他代谢疾病；(2)眼部接受过手术；(3)患有精神疾病，不能积极配合治疗者。另选同期85位健康体检者为对照组。纳入标准：(1)无眼部疾病；(2)既往无眼部手术史或激光治疗史；(3)自愿加入研究。排除标准：(1)近1mo内有眼局部用药史；(2)合并其它器官疾病者；(3)精神异常者。本研究均经受试者及家属签署知情同意书，且经本院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1样本采集在DE患者治疗前后分别采集样本，在对照组首次检查时采集样本。细胞采集：使用结膜印记细胞法，首先在受检者双眼结膜囊内滴入0.4%的盐酸奥布卡因滴眼液局部麻醉，然后在结膜染色15min后收集结膜上皮细胞，将结膜聚醚矾滤膜分为2份置于球结膜上，滤膜保存于RPMI1640细胞培养液中，从滤膜中获得细胞后放于冷冻管中，并保存于-20℃备用。泪液采集：使用毛细管采泪法，首先于受检者双眼内眦滴入2滴0.9%的生理盐水，数次瞬目使泪液与生理盐水充分混合，然后用毛细塑料管(内径0.3～0.5mm)收集受检者下睑穹窿或外眦处的泪液100μL，于-20℃保存备测。

1.2.2试剂与仪器Trizol试剂(南京森贝伽生物科技有限公司)，RNA逆转录试剂盒(上海羽哚生物科技有限公司)，2×SYBR Green PCR Master Mix试剂盒[易默(北京)生物技术有限公司]，引物(上海韵泰信息科技有限公司)，PCR扩增仪(BIO-RAD)。

1.2.3FOXO3水平检测DE患者样本中均加入Trizol试剂，进行总RNA的提取；根据RNA逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，按照2×SYBR Green PCR Master Mix试剂盒操作说明进行实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)试验，qRT-PCR条件：95℃初始变性30s，95℃ 30s、60℃ 30s和72℃ 30s，进行40个循环。以GAPDH为内参，引物序列见表1。相对表达量按照2-ΔΔCT法进行计算。

1.2.4IL-2水平检测IL-2水平检测采用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法，严格按照人IL-2 ELISA试剂盒操作说明进行，试剂盒购自上海广锐生物科技有限公司。

1.2.5临床指标检测泪膜破裂时间(break-up time，BUT)：将荧光素钠溶液均匀涂抹于患者下睑结膜囊中，用蓝钻光照射并认真观察暴露的角膜，记录瞬目后泪膜上第一次出现破裂点的时间，小于10s即为阳性，取3次结果的平均值；泪液分泌试验(Schirmer Ⅰ test，SⅠt)：轻拨患者的下睑，于下睑结膜囊中外1/3处放入滤纸，闭眼5min后记录滤纸湿润的长度，小于10mm/5min为阳性。角膜荧光素染色(cornea fluorescein staining，CFS)：0级即未染色；1级即呈散状点状染色；2级即呈密集状点状染色；3级即片状染色，阳性为2～3级。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.6治疗方法所有DE患者均行左氧氟沙星滴眼液和聚乙烯醇滴眼液治疗，均为1滴/次，每天5次，共2wk。

2结果

2.1两组受试者一般资料比较所有患者均完成随访，无失访病例。DE组106例中男36例，女70例，年龄40～61(平均52.36±4.84)岁。对照组85例中男31例，女54例，年龄40～60(平均51.61±4.79)岁，两组受试者性别比例、年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

2.2两组受试者结膜上皮细胞及泪液中FOXO3和IL-2水平比较与对照组相比，DE组患者结膜上皮细胞及泪液中FOXO3水平均明显降低，IL-2水平均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组受试者结膜上皮细胞及泪液中FOXO3和IL-2水平比较

2.3DE患者治疗前后结膜上皮细胞及泪液中FOXO3和IL-2水平比较与治疗前相比，DE患者治疗后结膜上皮细胞及泪液中FOXO3水平明显上调，IL-2水平明显下调，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表3。

表3 DE患者治疗前后结膜上皮细胞及泪液中FOXO3和IL-2水平比较

2.4结膜上皮细胞和泪液中FOXO3和IL-2水平的相关性Pearson相关性分析结果显示，结膜上皮细胞、泪液中FOXO3和IL-2水平均呈显著负相关(r=-0.531，P<0.01；r=-0.469，P<0.01)，图1、2。

图1 结膜上皮细胞中FOXO3和IL-2水平的相关性。

图2 泪液中FOXO3和IL-2水平的相关性。

2.5DE患者治疗前后临床指标变化DE患者治疗后BUT、SⅠt指标较治疗前上升，CFS指标下降，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表4。

表4 DE患者治疗前后临床指标变化

2.6DE患者结膜上皮细胞FOXO3和IL-2水平与临床指标的关系DE患者结膜上皮细胞FOXO3与BUT、SⅠt呈正相关，与CFS呈负相关，IL-2与BUT、SⅠt呈负相关，与CFS呈正相关(均P<0.01)，见表5。

表5 DE患者结膜上皮细胞FOXO3和IL-2水平与临床指标的关系

2.7DE患者泪液FOXO3和IL-2水平与临床指标的关系DE患者泪液FOXO3与BUT、SⅠt呈正相关，与CFS呈负相关，IL-2与BUT、SⅠt呈负相关，与CFS呈正相关(均P<0.01)，见表6。

表6 DE患者泪液FOXO3和IL-2水平与临床指标的关系

3讨论

随着人们生活环境、生活方式的改变及电子设备的使用率提高，DE的发生率也在不断上升，其具有女性比男性多，老年人高于青年人的发病特点。DE患者常常感觉眼睛干涩、有异物感、畏光、肿痛等，严重者甚至会引发结膜病变，造成视力低下，给人们的生活带来了许多的不便[10]。研究表明，DE的发生机制是由多种因素共同造成的，包括氧化应激、炎症、神经功能障碍、细胞凋亡等，其中氧化应激和炎症为DE发病的主要原因[11-12]。

FOXO3是FOXO家族中的一员，可在细胞核中与DNA结合，人们认为FOXO3是一种长寿基因，存在于机体的多种器官中[13]。FOXO3从细胞质到细胞核，通过调控相关基因表达而发挥抗氧化应激、调节细胞代谢等重要作用[14-15]。Chen等[16]研究表明，视网膜静脉阻塞患者血清中的FOXO3水平较对照组显著降低，且该疾病会促使患者发生全身氧化应激。Li等[17]研究表明，与年龄相关性白内障患者相比，糖尿病性白内障患者前囊细胞中AMPK依赖性转录因子FOXO3水平受到抑制，同时细胞的自噬活性随之下调，这可能是糖尿病白内障的潜在机制。有研究表明氧化应激与DE的发生密切相关。Liu等[18]研究发现，糖尿病DE小鼠角膜氧化应激明显增强，且角膜FOXO3水平较对照组显著降低。本研究结果发现，DE组患者结膜上皮细胞及泪液中FOXO3水平较对照组呈低表达，考虑可能与DE发病后氧化应激的增强有关；经过治疗，DE患者FOXO3水平明显上调，且BUT、SⅠt指标较治疗前明显上升，CFS指标明显下降，与Chen等[16]、Liu等[18]研究相似，提示FOXO3参与了DE的发生，经治疗后患者的眼表功能得到了一定的恢复。DE患者结膜上皮细胞、泪液FOXO3水平与BUT、SⅠt均呈显著正相关，与CFS呈显著负相关，提示FOXO3可反映DE患者病情的严重程度，可能是DE临床检测的生物标志物。

IL-2是由113个氨基酸残基组成的糖蛋白，为趋化因子家族中的一员，主要由T细胞和树突状细胞产生，参与多种生理和病理过程[19-20]。Pinto-Fraga等[21]研究发现，DE患者在接受治疗第22d后IL-2浓度显著下降，并表明IL-22可能是治疗DE的潜在生物标志物。Chen等[22]通过研究DE模型小鼠表明，在DE急性期IL-2的水平有所增加，而在炎症缓解后，IL-2水平下降到基线水平。Kwon等[23]研究发现糖尿病性黄斑水肿患者房水中IL-2水平较白内障患者显著升高。本研究中，DE组患者结膜上皮细胞及泪液中IL-2水平表达增加，DE患者治疗后结膜上皮细胞及泪液中IL-2水平较治疗前明显下调，与Pinto-Fraga等[21]、Kwon等[23]研究类似，提示IL-2参与DE发病，且其水平降低可能与患者病情得到缓解有关。DE患者结膜上皮细胞、泪液IL-2与BUT、SⅠt均呈显著负相关，与CFS呈显著正相关，提示IL-2在DE的发生过程中发挥促进作用，有望成为DE临床监测及疗效评估的有效参考指标。Pearson相关性分析结果显示，结膜上皮细胞、泪液中FOXO3和IL-2水平均呈显著负相关，提示其机制可能为患者机体FOXO3水平下降，抗氧化应激作用失效，氧化损伤发生，从而诱发炎症因子的释放，IL-2水平上升，进而导致DE的发生发展。

综上所述，DE患者结膜上皮细胞及泪液中FOXO3水平降低，IL-2水平升高，二者与患者眼表指标存在密切的联系，可判断DE病情的发展状况，有望成为DE临床监测及疗效评估的实验室辅助指标。DE的发病机制复杂，FOXO3、IL-2在DE发病过程中的具体机制尚需在今后的研究中进一步探索，从而为DE的防治提供可靠的参考依据。

2陈旭, 申颖. SCD-1、LYSC在干眼症患者结膜上皮细胞及泪液中表达及意义. 内蒙古医科大学学报 2020;42(4):444-448