高寒草甸植物叶片生态化学计量特征对长期氮肥添加的响应

2022-09-16游郭虹刘丹王艳丽王长庭

草业学报 2022年9期

游郭虹，刘丹，王艳丽，王长庭

（西南民族大学青藏高原研究院，四川成都 610041）

氮（nitrogen，N）是植物生长发育所必需的营养元素，陆地生态系统N输入来源包括自然源和人为源两种方式［1］。目前，人为源N输入量比自然源N输入量高出30%，比100年前的人为源输入量高出10倍［2］。人为源N输入量的剧烈变化促进了学者对N添加下生态系统过程及生物群落变化的大量研究。已有研究表明，人为N添加可以补充土壤N库、增加土壤N淋溶、改变土壤碳（carbon，C）固存、减轻植物N限制，促进植物生长发育［3-4］。然而，过量的N添加可导致土壤pH降低、土壤磷（phosphorus，P）限制加剧、植物生产力下降［5-6］。因此，N添加水平对生态系统的影响存在差异，研究不同N添加梯度下生态系统的响应及其影响因子对生态系统人为管理及预测全球变化下的生态系统N循环过程具有重要的理论和实践意义。

生态化学计量特征反映生态系统多重化学元素平衡状况，是探讨生命主要组成元素循环的有效方法［7-8］。植物叶片N/P生态化学计量特征可以反映植物对资源的获取和贮存情况，土壤的N、P有效性及植物对环境的适应性［9］。相关研究表明，植物叶片N含量可反映光合速率［10］，C/N和C/P可指示植物营养利用效率［11］，而N/P可反映环境对植物生长的养分供应状况［12］。如Koerselman等［13］对湿地生态系统研究指出，当N/P＜14时，植物生长主要受N限制；当N/P＞16时，植物生长主要受P限制；当14＜N/P＜16时，则受N和P的共同限制。Güsewell［12］对陆地生态系统研究表明，判断植物养分限制的N/P阈值为10和20。Zhang等［14］在内蒙古草原进行施肥试验，并提出将N/P＜21和N/P＞23作为判断植物生长养分限制的标准。因此，研究植物叶片生态化学计量特征对于深入了解土壤-植物元素平衡关系及预测未来全球变化下的植物生长策略具有重要意义。

N添加下植物生态化学计量特征变化受多种土壤环境因子影响，如土壤含水量（soil moisture content，SMC）、土壤紧实度（soil compactness，SC）、全碳（total carbon，TC）、全氮（total nitrogen，TN）、全磷（total phosphorus，TP）等。土壤养分一般以水溶液的形式被植物吸收利用［15］，SMC对植物的生长发育极为重要。相关研究指出，在土壤中无机N肥（如尿素）水解需要消耗土壤水分［16］，因此N添加可以通过改变SMC进而影响植物生态化学计量特征。无机N肥水解还可以产生H+，进而溶解土壤胶体中的钙，造成土壤解体使SC增加［17］。此外，N添加还可以通过改变土壤TN和TP含量来影响植物对养分的吸收［18］。有研究指出，施N可以直接改变土壤可利用N素，也可以活化部分土壤中的P［19］，进而影响植物生长发育。另有研究表明，土壤C是微生物的能源物质，是土壤养分转化的核心，影响着土壤肥力大小［20］。N添加有利于腐殖质的生成，促进残物分解产物向稳定性C转变，增加土壤TC的积累［21］。由此，N添加可以改变多种土壤环境因子，但是N添加下影响植物叶片生态化学计量特征变化的关键因子仍不明确。

青藏高原高寒草甸面积约为65.6×104km2［22］，覆盖青藏高原面积的40%左右［23］，是世界上最大的高寒草甸生态系统。青藏高原高寒草甸土壤有机质的分解和矿化作用受到低温限制，因此其土壤可利用N极低，仅占全N的1%［24］。同时，放牧导致地上部分养分归还量降低而N素的输出增加，致使土壤N素亏缺加剧［25］。在青藏高原高寒草甸开展N添加试验，对于改善高寒草甸植物N限制，提高高寒草甸生产力有实际的指导意义。本研究通过在青藏高原东缘红原县进行N添加的野外控制试验，比较不同功能群植物叶片生态化学计量特征对N添加的响应差异，探索不同功能群植物叶片生态化学计量特征与土壤环境因子之间的关系，揭示不同功能群植物对长期N添加的适应策略及其驱动因素。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

本研究于四川省红原县青藏高原生态保护与畜牧业高科技研究示范基地（32°49′48″N，102°35′24″E）内进行。该区位于青藏高原东缘，是青藏高原向川西平原过渡地带，平均海拔3494 m。属大陆性高原寒温带半湿润季风气候，年均温度1.1℃，1月为最冷月（平均温度-10.3℃），7月为最热月（平均温度10.9℃）。干湿季分明，年降水量650～800 mm，降水主要集中于5-9月。土壤类型为亚高山草甸土，呈弱酸性，土壤有机质分解缓慢，土壤养分含量丰富但有效养分含量较低［26］。高寒草甸为该区域主要的草地植被类型，禾本科优势种为垂穗披碱草（Elymus nutans）、洽草（Koeleria macrantha），莎草科优势种有无脉薹草（Carex enervis）和线叶嵩草（Kobresia capillifolia），优势豆科植物有多枝黄芪（Astragalus polycladus）和高山豆（Tibetia himalaica），优势杂类草植物包括草玉梅（Anemone rivularis）、钝苞雪莲（Saussurea nigrescens）和乳白香青（Anaphalis lactea）。

1.2 试验设计

样地设置于2012年5月下旬开展，在研究区内选取100 m×100 m地势平坦、植被分布均匀的高寒草甸作为试验样地，并设围栏保护。采用随机区组设计，在试验样地内布设6个10 m×30 m的区组，每个区组之间至少间隔3 m作为缓冲区。每个区组内，设置4个3 m×3 m的样方，每个样方之间至少间隔2 m作为缓冲区。对区组内的样方随机分别施0（CK）、10（N10）、20（N20）和30 g·m-2（N30）的尿素（CH4N2O，46.67% N），每个梯度重复6次，共计24个样方。在7年的连续施肥试验中，每年施肥1次。于每年5月上旬（植物返青期）选择在阴雨天或傍晚将肥料均匀地撒在各个样方内，雨水或次日形成的露水有利于肥料迅速溶解进入土壤。

1.3 样品采集及测定

供试样品采集于2018年8月中旬（植物生长旺季）进行，根据试验样地植物群落调查情况，对植物种进行重要值计算，利用重要值分别确定4种功能群中的优势种［27］。在试验样地内各施肥梯度下选择上述禾本科、莎草科、豆科、杂类草4种功能群的优势植物进行叶片样品采集（鲜重＞10 g），标记后置于自封袋中带回实验室。将采集的植物叶片105℃杀青后置于65℃下烘干至恒重，研磨并过筛（0.15 mm）。过筛后的样品用于植物叶片碳（leaf carbon，LC）、叶片氮（leaf nitrogen，LN）、叶片磷（leaf phosphorus，LP）含量的测定。

在各个样方中，利用土壤水分测定仪（TDR350，美国）和土壤紧实度仪（SC-900，美国）分别测定SMC和SC。然后用直径5 cm的土钻，按“S”型采样法分别对0～10 cm和10～20 cm土壤进行钻取，标记后装入自封袋，共48份土样。土壤样品经风干过筛后测定其TC、TN、TP含量。

采用杜马斯燃烧法［28］，利用元素分析仪（Vario macro cube，德国）测定植物叶片和土壤的C、N含量。采用钼锑抗比色法［29］测定植物叶片和土壤P含量，其中植物LP含量测定需先用浓硫酸（H2SO4）和双氧水（H2O2）消煮样品，土壤TP含量测定则需要先用浓硫酸和高氯酸（HClO4）消煮样品，再利用连续流动分析仪（Proxima，法国）进行测定。所有植物和土壤理化性质均进行了3次重复测定。

1.4 数据处理

通过生物量加权法［30］，计算每个样方植物群落水平上的C、N、P含量，计算公式如下：

式中：（C，N，P）com代表群落水平的C、N、P含量；（C，N，P）i代表第i个功能群的C、N、P含量；Bi代表第i个功能群的生物量；S代表功能群数量。

所有分析均在R 3.6.0中完成。采用单因素方差分析（one-way ANOVA），检验N添加对各功能群植物叶片生态化学计量特征参数及土壤理化参数的影响是否显著。如显著，则运用Tukey HSD方法进行事后多重比较。运用独立样本T检验，对相同处理不同土层间的土壤理化参数进行差异性分析。利用Person相关分析检验土壤理化因子与植物群落水平上LC、LN、LP、LC/N、LN/P和LC/P的相关关系，进一步采用冗余分析（redundancy analysis，RDA）找出影响植物叶片生态化学计量特征的关键环境因子并计算其贡献率。使用逐步回归方法，根据赤池信息量准则（akaike information criterion，AIC），选择最优RDA模型（最小AIC值）。最后，将关键环境因子与各个功能群植物叶片生态化学计量特征值进行线性拟合，分析各个功能群植物叶片生态化学计量特征值随环境因子的变化趋势。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质对氮添加的响应

在不同土层间，土壤TC、TN、N/P和C/P差异显著（P＜0.05），而土壤C/N、SMC和SC差异不显著。整体上，0～10 cm土壤TC、TN、N/P和C/P显著高于10～20 cm，而0～10 cm土壤TP含量仅在N10和N30处理下显著低于10～20 cm（表1）。

0～10 cm土层中，N10处理下的土壤TC和TN显著高于CK和N2（0P＜0.05），而N10处理下的土壤TP显著低于其他处理（P＜0.05）。土壤C/P、C/N和N/P均在N10处理下最高，而SMC在CK时最高（P＜0.05）。10～20 cm土层中，土壤TC、TP、C/N、N/P和C/P在不同施N梯度下差异不显著（P＞0.05）。土壤TN和SMC分别在N10和N30处理下最低，并显著低于CK和N2（0P＜0.05）。N10和N20处理下SC显著高于CK（P＜0.05，表1）。

2.2 植物LC、LN、LP对氮添加的响应

在自然状态（CK）下，LC、LN、LP含量均为豆科最高，分别为451.44、19.50、3.58 g·kg-1。单因素方差分析表明，N添加对莎草科和杂类草LC影响不显著，而对禾本科和豆科LC影响显著（P＜0.01）。N10、N20及N30处理下禾本科LC含量显著高于CK，而N20处理下豆科LC含量显著低于CK（P＜0.05，图1A）。N添加显著提高禾本科、莎草科、豆科和杂类草LN含量（P＜0.001，图1B）。在N30处理下，禾本科、莎草科、豆科和杂类草LN含量较CK分别提高了49.37%、24.66%、31.46%和117.14%。N添加对禾本科、豆科和杂类草LP含量影响均达到显著水平（P＜0.01，图1C）。禾本科和杂类草LP含量随施N量增加呈先降低后增加趋势，且均在N10处理下最低。N10、N20、N30处理下豆科LP含量均低于CK，且在N30处理下达到最低。

图1 不同梯度氮添加下植物LC、LN、LP含量的变化Fig.1 Changes of LC，LN and LP contents of plants with different nitrogen gradients

2.3 植物LC/N、LN/P、LC/P对氮添加的响应

自然状态下，4种功能群间LN/P差异不明显，豆科的LC/N和LC/P较禾本科、莎草科和杂类草低。N添加对4种功能群LC/N、LN/P和LC/P作用均达到显著水平（P＜0.01）。整体上，4种功能群LC/N随施N量增加呈降低趋势，而LN/P呈增加趋势（图2A，B）。禾本科和杂类草LC/P随施N量增加呈先增加后降低趋势，而莎草科和豆科LC/P随施N量增加整体呈增加趋势（图2C）。莎草科和豆科的LN/P和LC/P在N30处理下最高，而杂类草LN/P和LC/P的峰值出现在N10处理下，且均显著高于CK（P＜0.05）。N10和N20处理下，禾本科LN/P和LC/P均显著高于CK（P＜0.05）。

图2 不同梯度氮添加下植物LC/N、LN/P、LC/P的变化Fig.2 Changes of plant LC/N，LN/P and LC/P under different nitrogen addition levels

2.4 影响植物叶片生态化学计量特征的因子

Pearson相关分析显示，土壤TC、TN和SC与植物叶片生态化学计量参数均不相关，而土壤SMC与其均显著相关（P＜0.05，表2）。SMC与植物LC、LN、LN/P和LC/P显著负相关（P＜0.05），而与LP和LC/N显著正相关（P＜0.01）。此外，土壤TP、N/P和C/P均与植物LP、LN/P和LC/P显著相关（P＜0.05），土壤C/N仅与植物LP和LC/N显著相关（P＜0.05）。

表2 植物叶片生态化学计量特征值与环境因子的Pearson相关性Table 2 Pearson correlations between ecological stoichiometric characteristics of plant leaves and environmental factors

在RDA分析中，RDA第一轴和第二轴分别表征植物叶片生态化学计量特征值的62.36%和14.45%（图3）。在最优RDA模型中，环境因子对植物叶片生态化学计量特征参数的总贡献率为12.82%（P＜0.05），其中土壤SMC、TP和TN的贡献率分别为10.28%（P＜0.001）、1.39%（P＜0.05）和1.15%（P＞0.05）（表3）。

表3 最优RDA模型中环境因子对植物叶片生态化学计量特征变异的贡献率Table 3 Contribution rate of environmental factors to variation of ecological stoichiometry characteristics of plant leaves in the optimal RDA model

图3 植物叶片生态化学计量特征与环境因子RDA分析Fig.3 RDA analysis between ecological stoichiometry characteristics of plant leaves and environmental factors

基于Pearson相关分析和RDA分析，土壤SMC对植物叶片生态化学计量特征的影响显著，回归分析用于进一步探索SMC与不同功能群植物叶片生态化学计量特征的关系（图4）。整体上，莎草科、豆科和杂类草对SMC增加的响应较禾本科敏感。在LC、LN、LP、LC/N、LN/P和LC/P这6个指标中，莎草科、豆科和杂类草分别有2、3和5个指标对SMC增加有显著变化，而禾本科仅有1个指标有显著变化。

图4 土壤含水量与植物叶片生态化学计量特征之间的线性拟合Fig.4 Linear fitting between soil moisture content and ecological stoichiometry characteristics of plant leaves

禾本科仅LC随SMC增加呈显著的线性下降关系（P＜0.05），LN、LP、LC/N、LN/P和LC/P随SMC增加变化不显著。随SMC增加，莎草科LC、LN、LP、LC/N变化不显著（P＞0.05），而LN/P和LC/P呈显著的线性下降趋势（P＜0.05）。豆科LC、LN和LC/N随SMC增加保持相对稳定，其LP随SMC增加呈线性增加，而LN/P和LC/P呈线性降低趋势（P＜0.05）。杂类草LN、LN/P和LC/P随SMC增加而显著下降（P＜0.05），但其LP、LC/N随SMC增加而显著增加（P＜0.01）。

3 讨论

3.1 氮添加对土壤理化性质的影响

土壤是草地生态系统中植物与环境相互作用的重要枢纽，其理化性质是评价土壤质地与肥力的重要指标。土壤C/N可反映土壤有机质分解速度和N素矿化能力高低［31］，土壤N/P常作为判断N、P养分限制的指标［8］，而土壤C/P则反映土壤P素有效性高低［32］。本研究结果表明所有处理下土壤C/N、N/P和C/P的均值分别为10.83、5.16和55.92，与我国土壤C/N（11.9）、N/P（5.2）和C/P（61）的平均水平相比较低［33］。此外，自然状态下0～10 cm和10～20 cm土层N/P分别为4.94和4.47，均低于全球草地N/P平均值（5.6），且远远小于10［34］，表明青藏高原高寒草甸生态系统受到一定的N限制。同样，张仁懿［35］也认为青藏高原高寒草甸土壤由于低温限制，微生物活动较弱，有机质分解较慢，其N素有效性低。

施N会改变土壤的养分状态，进而影响土壤的物理化学性质。N添加对土壤TN含量影响显著，N10处理下表层土壤TN含量较N20和N30处理高，这可能与地上植物对土壤N的吸收有关［36］。本研究发现禾本科、莎草科和豆科LN含量在N20和N30处理下均显著高于N10处理，植物LN积累是以消耗土壤N素为前提的，N素更多地分配于地上植物，导致土壤中的TN含量减少。在草地生态系统中，较高的土壤C/N通常表征土壤有机质分解速度较慢［31］，N添加下土壤C/N呈先升高后降低趋势，在N10处理下达到峰值，表明低N添加可能使微生物对有机质的分解速率降低，促进土壤有机质的累积。同时，本研究发现N10处理下土壤TC含量显著高于其他处理，进一步证明低N添加可促进土壤有机质的累积。表层土壤N/P随施N量增加而增加，外源N添加使N元素得到迅速补充，而P未得到补充所引起的N/P上升。本研究发现，施N条件下，SMC整体呈下降趋势，这与前人的研究结果一致［37-38］。相关研究指出，N添加对土壤水分条件具有明显的依赖性，1分子尿素水解需要2分子的水［16］，因此尿素水解需要消耗大量的水分，这是SMC随施N量增加而降低的原因之一。同时N添加会使土壤速效成分增加，植物吸收后有利于其根系发育，促进水分吸收，使得SMC下降［39］。此外，杨泽等［37］研究表明，N添加增加了地上生物量和植株高度，植物蒸腾作用加大，致使土壤的水分含量降低。

3.2 氮添加对植物叶片生态化学计量特征的影响

植物LC、LN、LP营养元素含量可反映植物对土壤养分的吸收利用及贮存状况。自然状态下，豆科较其他3种功能群植物LC、LN和LP高。同样，在呼伦贝尔草甸草原［40］、黄土高原温带草原［41］、昆仑山温带草原［42］及青藏高原高寒草甸［43］的研究均表明自然状态下豆科植物叶片养分含量较其他类型植物高。这是由于豆科植物根系的根瘤菌具有固N能力［44］，可促进豆科植物有机质累积及养分贮存。前人研究表明，N、P含量低的植物具有较强的资源保守性，可以通过提高资源的利用率来克服干扰［45］，更易在N限制区成为优势种［44］。本研究中禾本科和莎草科在自然状态下LN、LP含量较低，同时其在青藏高原高寒草甸地区是优势类群。

随施N量增加，莎草科和杂类草植物LC含量整体变化不显著，表明施N并未显著改变莎草科和杂类草有机质的积累，这与前人研究结果一致［46］。C作为植物的结构性物质，能稳定分布在植物中，不易受环境因子影响。相反，N、P作为植物功能性物质具有制约植物生长的功能，其含量受环境变化影响较大［43］。宾振钧等［47］在高寒草甸研究表明N添加显著提高了垂穗披碱草的LN含量。高宗宝等［46］研究发现N添加显著提高了呼伦贝尔草甸草原羊草（Leymus chinensis）、贝加尔针茅（Stipa baicalensis）和狭叶柴胡（Bupleurum scorzonerifolium）的LN含量。李冬冬［48］研究表明，每个N添加处理下北方草甸草原植物LN含量均大于对照。同样，本研究发现随施N量增加，禾本科、莎草科和杂类草LN含量整体呈增加趋势，这与前人的研究结果一致。相关研究认为，豆科植物自身具有固N功能，N不能成为其生长限制因子，因此豆科LN在施N条件下变化不显著［40］。然而，本研究中发现豆科植物LN在20和30 g·m-2的尿素添加下较CK分别提高了15.24%和31.45%，这可能是由于在土壤N供应充足时，豆科植物叶片存在对N元素的奢侈吸收，即豆科植物能储存超过其需要的养分量，从而为生殖生长或环境变化提供足够的养分储备［49］。此外，由于施N增加了土壤中可利用的N素，豆科植物地上生物量增加［19］，累积的生物量稀释了豆科植物LP含量［50］，使得豆科植物LP随施N量增加而下降。另有研究表明，N添加提高了土壤中N含量而未改变土壤中P的供给，这种N、P供应的不平衡潜在提高了豆科植物对P的需求［19］。

植物LC/N和LC/P可反映植物在吸收养分元素时对C的同化能力，通常低LC/N和LC/P对应高的生长速率［51］。这种对应关系与植物所受的养分限制类型有关，当植物生长受N限制时，生长速率和LC/N呈负相关，而当植物生长受P限制时，生长速率和LC/P呈负相关［52］。本研究中植物生长主要受N限制，且中高N水平添加（N20和N30）显著降低了4种功能群植物的LC/N，表明中高N水平添加提高了各个功能群植物的生长速率。植物组织LN/P值常被用来评估植物的养分限制状况，并且这种养分平衡关系适用于青藏高原高寒草地生态系统［53］。前人研究表明，陆生植物N/P＜10时植物生长受N限制，当N/P＞20时植物生长受P限制［12］。本研究中，自然状态下所有功能群植物的LN/P值均小于10，进一步表明该区域植物的生长主要受N限制。随施N量增加，4种功能群植物LN/P整体呈增加趋势，表明施N可以适当缓解高寒草甸植物的N限制。然而在关于N/P阈值的普适性的研究中，鉴于固N植物对N素独特的反应和利用，Sadras［54］综合全球众多施肥试验提出豆类作物获得最高产量的最佳N/P值为8.7。Han等［55］研究得到豆科植物的临界N/P值为8。本研究中，N添加使豆科LN/P逐渐增加并在N20（8.13）、N30（16.66）处理时超过8，且N20处理时豆科植物N/P值最接近前人指出的豆科植物N/P阈值，表明青藏高原高寒草甸最适豆科植物生长的是20 g·m-2尿素添加。整体上来看，20～30 g·m-2的尿素添加量能够较好地缓解青藏高原高寒草甸植物生长的N限制。

3.3 氮添加下土壤-植物叶片生态化学计量特征的关联性

植物在固C过程中需从土壤中获取N和P供自身生长，同时植物C、N和P以凋落物和分泌物的形式回归土壤。Pearson相关分析显示，土壤TN与植物叶片生态化学计量参数均不相关，表明N添加下土壤TN不一定是影响植物养分含量的关键调控因素［56］。这是由于在土壤中仅仅部分速效N能直接被植物吸收利用［57］。在本研究中，植物LP含量与土壤TP含量具有显著正相关关系，这说明土壤TP含量的高低影响着植物叶片对P元素的摄取［58］。在所有环境因子中，SMC与植物叶片生态化学计量参数均显著相关（P＜0.05），且SMC对植物叶片生态化学计量特征变化的贡献率最高（10.28%），表明SMC是影响植物LC、LN和LP的关键因子。研究区降水量丰沛［26］，植物生长虽不受水分限制，但土壤水分是土壤-植物间养分转化和传递的重要参与者。

植物吸收的养分一般是水溶态的，SMC对N、P等养分的溶解、迁移、扩散和转化具有重要影响［59］。本研究发现，SMC与植物LC和LN显著负相关，可能由于低SMC的土壤淋溶作用较弱，土壤养分充足，因此植物LC和LN较高［35］。4种功能群LN随SMC增加而下降的速率由大到小依次为杂类草、禾本科、莎草科和豆科，因豆科植物具有稳定的N输入途径（根瘤固N），所以其LN受环境因子影响较小。相反，SMC与植物LP显著正相关，是因为当SMC较少时植物可通过降低自身P含量来降低辅酶和能量物质合成以维持基本代谢［60］。4种功能群植物LP随SMC增加而增加的速率由大到小依次为豆科、杂类草、禾本科和莎草科，豆科和杂类草LP响应较敏感的原因可能是其叶片自身的含水量较高［61］。LN/P和LC/P随SMC增加呈降低趋势，这与前人研究结果一致［62］。SMC增加会增加TN淋溶损失，同时降低LC储存能力，致使LN/P、LC/P降低［63］。LC/N随SMC增加而增加，这是由于低SMC条件下，植物更倾向于累积LN来提高光合速率、水分利用效率，减少水分散失［64］。植物为了获取足够的水分来保证生长，其根系的空间分布也会随SMC的异质性发生改变，从而维持群落结构的多样性［65］。在高寒草甸，大多数杂类草的根系较浅且多为轴根，很难在致密的草毡层内生存，对SMC的竞争力较弱，且耐受性较低［66］。另有研究表明，杂类草与其他功能群相比具有较大的叶面积［67］和较高的蒸腾强度［68］，因此杂类草受SMC的影响更为显著。