多环芳烃中苯并[g,h,i]苝与特发性膜性肾病的关联

张献鹏 田 飞 刘 畅 尹 磊 黎多品 史 嫣 潘少康， 刘东伟， 刘章锁，

随着现代工业化和城市化的快速发展,空气污染已经成为针对全球公众健康的一种非常现实的威胁,主要空气污染物包括氮氧化物、硫氧化物、一氧化碳、细颗粒物(PM)等。颗粒物直径≤10 μm的PM,被称为可吸入PM(PM10)，根据直径进一步细分为粗颗粒(PM10-2.5,2.5～10 μm)、细颗粒物(PM2.5,≤2.5 μm)和超细颗粒物(PM 0.1,≤0.1 μm)[1]。据报道,从1990—2015年,全球归因于PM2.5的死亡人数从350万人增至420万人[2]。2018年,一项基于40 759例经活检证实患有肾脏疾病的回顾性研究证实,膜性肾病已成为我国原发性肾小球疾病的第二大病理类型[3]。膜性肾病常分为特发性膜性肾病(IMN)和继发性膜性肾病(SMN)。 Xu等[4]的研究发现,在PM2.5水平>70 μg/m3的地区,PM2.5浓度每增加10 μg/m3,患IMN的概率增加14%。随后,中国的另一项研究证实了这种关联[5]。多环芳烃(PAHs)是PM2.5中重要的小分子有机物之一,主要包含16种组分:二苯并[a,h]蒽[dibenzo(a,h)anthracene,DBA]、苯并[b]荧蒽[benzo(b)fluoranthene,BbF]、苊烯(acenaphthylene,ANY)、芴(fluorene,FLU)、屈(chrysene,CHR)、苯并[a]蒽[benzo(b)anthracene,BaA]、苊(acenaphthene,ANA)、蒽(anthracene,ANT)、芘(pyrene,PYR)、茚并[1,2,3-cd]芘[indeno(1,2,3-cd)pyrene,IPY]、菲(phenanthrene,PHE)、萘(naphthalene,NAP)、荧蒽(fluoranthene,FLT)、苯并[k]荧蒽[benzo(k)fluoranthene,BkF]、苯并[a]芘[benzo(a)pyrene,BaP]、苯并[g,h,i]苝[benzo(g,h,i)perylene,BghiP][6]。本研究团队前期探究发现，在IMN患者中PAHs水平较高,其可能与IMN的发病相关[7],另外,其成分BbF可能通过抑制足细胞自噬参与IMN的发生发展[8],但PAHs其他成分是否也参与IMN的发病尚无相关研究。本研究拟在前期研究的基础上,通过测定IMN患者血液中PHAs主要成分的含量,从临床角度分析其主要成分与IMN的相关性,以期为IMN的发病和发展提供新思路。

对象和方法

研究对象选择2020年6月至2020年9月经郑州大学第一附属医院肾内科肾活病理证实的IMN患者30例、SMN患者10例。纳入标准:(1)至我院就诊的初诊患者;(2)经我院肾活检病理诊断为IMN或SMN,IMN和SMN的诊断标准参考《肾脏病学》[9],其中SMN患者主要继发因素包括自身免疫病、感染、恶性肿瘤、药物及重金属[9];(3)临床表现为肾炎综合征或肾病综合征。排除标准:(1)病理诊断中合并其他类型病理改变;(2)曾使用糖皮质激素和(或)免疫抑制剂及细胞毒性药物治疗;(3)患有肿瘤或者进入终末期肾病患者。所有患者均已签署知情同意书,该研究获得郑州大学第一附属医院伦理审查委员会批准(编号:2019-KY-014)。

标本留存及处理分别采用紫头乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管及红头促凝管收集每例入组患者晨起空腹血标本各3 mL。红头管经4 ℃、3 000 r/min离心10 min后留取上层血清于-80 ℃环境保存,后采用ELISA试剂盒检测血清转化生长因子β1(TGF-β1)水平。紫头管经避光处理后保存于4 ℃环境,后避光送至郑州市普利莱医学检验所利用高效液相色谱仪LC-20AD进行PAHs中16种主要成分的浓度检测。

临床资料收集患者基本资料及临床信息通过我院电子病历系统收集,主要项目包含性别、年龄、尿素氮、血清肌酐、血尿酸、总蛋白、白蛋白、总胆固醇、三酰甘油、估算的肾小球滤过率(eGFR)、24h尿蛋白、血清抗磷脂酶A2受体(PLA2R)抗体。

统计学方法采用《SPSS 24.0》统计软件进行数据的统计学处理。计量资料符合正态分布时以均数±标准差表示,组间比较采用t检验;符合非正态分布时采用中位数(四分位间距)表示,组间比较采用 Mann-Whitney U 检验。计数资料以例数表示,组间比较采用χ2检验。相关性分析时,符合正态分布的计量资料采用Pearson相关分析,符合非正态分布的则采用Spearman相关分析。以上检验均为双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一般资料IMN组和SMN组患者性别、年龄、吸烟史、居住地、尿素氮、血清肌酐、血尿酸、总蛋白、白蛋白、总胆固醇、三酰甘油、eGFR、24h尿蛋白、TGF-β1差异均无统计学意义,血清抗PLA2R抗体阳性比例及肾组织PLA2R抗原免疫荧光强度有明显统计学差异(均P<0.001)(表1)。IMN组PAHs各成分浓度以BghiP平均浓度最高,约1.259 μg/mL,SMN组PAHs各成分浓度以NAP平均浓度最高,约0.762 μg/mL;两组间PAHs各成分的浓度相比,NAP及BghiP的浓度差异各具有统计学意义(P值分别为0.042、0.004)(图1)。两组血清TGF-β1浓度差异无统计学意义(P=0.283)。

表1 两组患者一般资料

BghiP与临床指标的相关性分析如表2所示,IMN组患者BghiP浓度与24h尿蛋白、血清抗PLA2R抗体、总胆固醇水平均呈正相关,与总蛋白、白蛋白水平均呈负相关;SMN组患者BghiP浓度与临床指标的相关性分析无统计学意义。

IMN患者BghiP与TGF-β1相关性分析IMN患者血清BghiP浓度与TGF-β1呈正相关(图2),线性回归分析显示,BghiP浓度每升高1 μg/mL,TGF-β1浓度便升高 0.112 ng/mL(β=0.112,t=3.562,P=0.001)。

讨 论

PM2.5作为造成我国空气污染的重要因素之一,其直径小,数量多,吸入后可滞留在终末细支气管和肺泡内,甚至越过血气屏障,到达肝脏、肾脏等血液循环部位,造成不同程度的损害[10]。肾脏作为血液循环最丰富的器官之一,极易受到血液中各种有害因素的损伤。一项涉及10 997例患者的队列研究发现,较高的PM2.5暴露与较高的蛋白尿水平和较高的慢性肾脏病发病风险相关。PAHs是PM2.5中的一组小分子有机物,具有致癌性、诱变性和致畸性[11]。前期研究发现IMN组患者血液中PAHs浓度明显高于SMN组[7]。BghiP是一种环化六环芳香烃,主要由有机物的不完全燃烧产生,是美国环境保护局控制的PAHs的主要成分[12]。在污染严重的城市比如墨西哥城,BghiP是大气中含量最丰富的PAHs,主要是由汽车发动机中汽油的不完全燃烧产生的[13]。Shen等[14]2019年检测发现BghiP是我国PAHs中含量最丰富的三个种类之一。因为1983年国际癌症研究机构的一项研究表明,BghiP对动物和人类都不会致癌[15],关于BghiP的研究几乎停滞不前。然而,有关BghiP的遗传毒性一直存在争议。近年来,许多研究表明BghiP不仅可以与DNA形成结合物导致肺癌[16],而且还可与BaP协同作用增加致癌作用[17]。最新的研究报告表明,BghiP可破坏细胞膜,刺激芳香烃受体(AhR)的转位诱导基因转录,并通过AhR途径对NL-20人支气管细胞株产生毒性作用[18],另外BghiP还会通过扰乱小鼠卵母细胞线粒体的分布,增加氧化应激水平,诱导卵母细胞的凋亡[19],这与前期我们研究团队发现PAHs可能通过氧化应激参与IMN的发生发展有相似之处[7]。但是,有关BghiP与IMN的关系,至今无相关研究报道。

表2 BghiP浓度与检验资料的相关性分析

图2 IMN患者血清BgihP与TGF-β1相关性散点图IMN：特发性膜性肾病；BghiP:苯并[g,h,i]苝;TGF-β1:转化生长因子β1

本研究通过检测、对比PHAs的16种主要成分的浓度发现,BghiP浓度在IMN组患者中最高(约为1.259 μg/mL),在SMN组中也位居第三(约为0.300 μg/mL),且两组之间BghiP浓度的差异具有统计学意义,与临床指标相关性方面,BghiP浓度与反映肾脏损伤的24 h尿蛋白呈正相关,而与血清总蛋白、白蛋白呈负相关,提示BghiP可能参与了IMN的发生或发展过程。值得注意的是,研究发现70%～80%的IMN患者血清抗PLA2R抗体检测呈阳性[20],监测血清抗PLA2R抗体水平变化可更好地预测IMN的进展和预后[21]。本研究发现BghiP浓度与IMN组患者血清抗PLA2R抗体呈正相关,且与肾组织PLA2R抗原免疫荧光强度之间也存在相关性(r=0.425,P=0.019),进一步证实了BghiP与IMN发生密切相关。

TGF-β是肾细胞合成细胞外基质蛋白的关键调节因子,还可参与肾细胞的增殖、肥大和凋亡,在人体中最常见亚型为TGF-β1。Kim 等[22]研究发现TGF-β1在膜性肾病患者的足细胞中的表达上调。为进一步探索TGF-β1与IMN患者的相关性,本研究检测了两组患者血清中TGF-β1水平,结果显示,IMN组患者中TGF-β1浓度并无明显升高,但其也与IMN的标志物血清抗PLA2R抗体呈正相关(r=0.376,P=0.040),进一步分析发现,BghiP与TGF-β1之间存在线性回归关系(R2=0.312,P=0.001),提示TGF-β1可能参与到 BghiP 导致 IMN 发生和发展的过程中,遗憾的是本研究并未发现 BghiP 和 TGF-β1 同IMN 患者肾脏病理指标如肾小球硬化比例、肾小管扩张或萎缩、肾间质纤维化等之间有明确相关性,BghiP和TGF-β1参与IMN的具体机制仍需进一步探究。

小结:本研究发现IMN患者血液中BghiP浓度与24h尿蛋白、血清抗PLA2R抗体、总胆固醇水平均呈正相关,与总蛋白、白蛋白水平均呈负相关,且与TGF-β1浓度呈线性正相关,提出了BghiP可能与IMN的发生发展密切相关,同时TGF-β1可能参与到BghiP导致IMN发生和发展的过程中,为膜性肾病的防治提供了新思路,但其相关具体作用机制还有待于基础研究、更大样本量和长期队列随访研究的继续推进。