应用生物信息学从铁死亡角度筛选治疗慢性肾脏病天然药物成分

徐启明 刘伟伟 路建饶

慢性肾脏病(CKD)是不同原因导致慢性肾脏结构与功能的障碍[1]。中国 CKD发生率约10.8%[2],其中约10%的患者最终将进展为终末期肾病(ESRD)。CKD给社会和人民造成了巨大的经济负担,已成为严重威胁人类健康的公共卫生问题之一。

铁死亡是一种铁依赖性脂质过氧化物积累到致死水平的新型的细胞程序性死亡方式。近几十年来,在肾脏疾病领域发现以铁死亡为代表的非传统形式的细胞死亡,尽管不断探索铁死亡和急性肾损伤(AKI)之间的相互作用[3],但对铁死亡和CKD的研究仍然有限。通过明确铁死亡与CKD的共同发生机制,预测铁死亡对CKD的治疗潜力,以期为铁死亡和CKD提供见解[4]。本研究通过生物信息学分析从铁死亡角度筛选出治疗CKD的天然药物成分,以期在CKD的治疗方法上取得进展。

材料与方法

CKD数据集的收集及筛选差异基因通过在GEO数据库[5]下载GSE66494和GSE120683数据集,运用R软件对这两组数据集行标准化处理,后用ggord包进行主成分析(PCA),绘制去除批次后的PCA结果图,接下来使用limma包(版本3.40.2)研究mRNA的差异表达。

铁死亡相关基因收集及交集基因的获取通过FerrDb平台[6]获取与铁死亡相关的基因,再将上述步骤中得到的差异表达基因(DEGs)与铁死亡相关基因导入jvenn平台[7]进行取交集操作,并获得交集基因的Venn图。

交集基因进行功能富集分析(GO及KEGG)为了进一步了解上述筛选出的基因的研究信息,将分析得到的交集基因导入中R软件中,并运用clusterProfiler、pathview等R包进行GO及KEGG分析,以期得到铁死亡干预CKD的可能途径。

蛋白互助网络(PPI)蛋白互助网络分析将上述获得的交集基因导入STRING数据库[8]来检索相互作用基因以构建PPI,再将其导入Cytoscape软件揭示PPI网络中具有高度连接节点的中心基因。

通过铁死亡治疗CKD的天然药物及成分筛选symMap平台[9]是一个中医药证候关联数据库,将上述获得的交集基因输入,获得通过铁死亡治疗CKD的天然药物。再将预测排名靠前的中草药导入TCMSP数据库[10]中,通过“口服生物利用度>30%”、“类药性>0.18”、“药物半衰期≥4h”及“分子量介于180～500 Da”筛选有效成分,并使用UniProt数据库[11]对所有靶点ID进行标准化校正。

分子对接验证通过TCMSP数据库中检索与铁死亡相关的CKD核心靶点，比对得到预测天然药物小分子的靶点,利用PDB数据库[12]下载核心靶点的3D结构,再利用PubChem数据库[13]得到的天然药物sdf格式。运用MOE软件将小分子化合物及靶蛋白进行对接。

结 果

CKD中DEGs筛选本研究中,通过GEO数据库检索了GSE66494和GSE120683数据集的基因表达特征。其中,GSE66494微阵列数据共有53份活检标本,GSE120683微阵列数据包括6个样本,对具体成分的进一步分析表明,两数据集均为探索人类CKD的基因表达谱,包含着CKD中与肾小管间质纤维化和肾小管上皮细胞损伤相关的负责基因。

首先将2个数据集标记为不同批次,采用removeBatchEffect函数进行去除批次效应,通过箱线图进行评估数据标准化情况(图1A),结果显示,样本的中位数基本位于一条水平直线,提示基因芯片质量良好,两分组之间的数据具有比较意义;数据批次效应情况通过对比批次去除前后可视化PCA图进行评估(图1B、C),提示可继续用于下一步的研究。然后提取两个数据集共有的gene symbol,一共得到了1 021个DEGs,其中包含221个上调基因和800个下调基因,并以“AdjustedP<0.05且log2(倍数变化)>1或log2(倍数变化) <-1”为初步筛选条件绘制火山图(图1D)以及热图(图1E)。

图1 慢性肾脏病中差异表达基因筛选A:数据标准化后箱线图;B、C:两个数据集批次去除前、后的PCA结果;D:差异基因火山图;E:差异基因表达热图

CKD差异表达与铁死亡交集基因我们从FerrDb平台获取与铁死亡相关的基因共259个,将该基因与上述步骤中得到的有关CKD的DEGs汇总后,通过jvenn平台做取交集处理(图2),共得到交集基因18个,这些靶点代表着同时参与铁死亡过程及CKD的发生。

图2 交集基因的Venn图

GO与KEGG功能富集分析上述步骤中得到的18个交集基因,运用clusterProfiler,pathview等R包进行GO及KEGG功能注释。GO分析共获得393个条目,其中生物过程(BP)共有325条,细胞组分(CC)共有12条,分子功能(MF)共有56条。选取差异最显著的10个功能进行排序分析(图3),BP主要涉及细胞解毒,有机酸分解代谢过程,细胞对皮质类固醇的反应等功能;CC主要涉及核膜,内吞作用的囊腔及内质网腔等功能簇;MF主要涉及氧气结合,氧化还原酶活性,抗氧化活性等功能簇。

图3 GO功能富集分析的BP、CC、MF三合一条形图BP:生物过程;CC:细胞组分;MF:分子功能

KEGG功能富集分析表明上述基因主要富集于60条信号通路,再以“P<0.05”为筛选条件,最终得到9条信号通路,分别为mTOR信号通路、PPAR信号通路、甘油磷脂新陈代谢、PI3K-Akt信号通路等相关信号通路(图4)。

图4 KEGG功能富集分析气泡图

PPI网络分析将上述步骤中得到的交集基因导入STRING在线分析工具中,得到了交集基因构建的PPI网络(图5A),再将PPI 网络信息导入Cytoscape软件中,导出18个核心基因,分别为PLIN4、ATF3、PCK2、ANGPTL7、TSC22D3、MIOX、ACSF2、PTGS2、DUSP1、CBS、DDIT4、FLT3、TAZ、SLC3A2、ALB、GPT2、LPIN1、HBA1。以度值为筛选标准对交集基因进行排列,其中排名最高的基因为ALB,排名最低的基因为ACSF2;FLT3为上调表达基因,其余17个核心基因均为下调基因(图5B)。

图5 PPI网络图A:47个PPI边缘和18个节点作用网络图;B:中倒置三角形代表下调基因,三角形代表上调基因

天然药物及其成分的筛选将上述得到的18个核心基因导入symMap平台,以P<0.05为筛选条件,共得到了534味天然药物,并进一步通过TCMSP及部分文献检索其对应来源天然药物及作用靶点,柠檬酸、香豆雌酚为最有可能治疗CKD的天然小分子药物,其来源于大黄、芦荟、虎杖、葛花等。

分子对接将上述得到的核心靶点及其对应的天然药物成分导入Cytoscape软件中,通过度值以及与CKD关联度为筛选条件,得到了3个核心靶点,分别为PTGS2、ATF3、GPT2,以及2个关键活性成分,分别是Citric Acid和Coumestrol(图6)。通过MOE软件计算3个核心靶点和2个关键活性成分间的最低结合能,分子对接结果分析得出PTGS2与香豆雌酚对接时未能找到结合位点,故予以剔除;ATF3与香豆雌酚的结合能最低,为-5. 5874kJ/mol,表明该配体与受体的构象最为稳定(表1)。具体对接结果见图7和图8。

图6 活性成分-靶点图

表1 关键活性成分与核心靶点间的最低结合能

图7 分子对接2D结果图A、B、D:分别为柠檬酸与靶点PTGS2、ATF3、GPT2对接图;C、E:分别为香豆雌酚与靶点GPT2、ATF3对接图

图8 天然小分子与靶点分子对接3D图

讨 论

CKD是由各种不同因素而导致的肾脏的不可逆性结构和功能障碍,若未得到有效救治,患者可能快速进展至ESRD,危及生命安全。而在近几年的研究中表明,铁死亡在CKD领域中发挥着重要作用,Ferrostatin-1可能通过抑制脂质过氧化和促进GPX4表达而抑制纤维化发展[14]。最近一项研究表明,在叶酸所致的肾损伤中,罗沙司他能够通过抑制铁死亡减轻肾损伤及肾纤维化[15],通过干预铁死亡或能成为治疗CKD的新途径。在目前研究中,铁死亡相关诱导剂和抑制剂在治疗CKD中取得了一定进展,但是绝大多数仍然停留在动物实验阶段,向临床转化以及开发新型精准药物值得期待。相关研究表明许多天然药物在治疗CKD上具有一定疗效[16],但其具体作用成分仍不明确。通过明确铁死亡与CKD共同的表达靶点并定位其具体天然药物成分,可为CKD的治疗带来创新。

本研究通过生物信息学分析筛选得到可能从铁死亡角度治疗CKD的18个核心靶点,分别为PLIN4、ATF3、PCK2、ANGPTL7、TSC22D3、MIOX、ACSF2、PTGS2、DUSP1、CBS、DDIT4、FLT3、TAZ、SLC3A2、ALB、GPT2、LPIN1、HBA1。GO分析显示其生物过程包括小分子分解代谢过程,细胞糖皮质激素刺激的反应以及抗氧化活性等。有研究表明,肾脏氧自由基的产生及清除失衡是CKD发生发展众多因素中的一种重要致病机制[17],本研究也发现,显著性DEGs主要富集在氧结合及抗氧化过程,提示肾脏缺氧可能会促进CKD的发生。KEGG分析显示核心基因主要富集在mTOR、PPAR等相关信号通路。mTOR信号通路的激活被证实是miRNA激活的主要反应性元素,在肾脏疾病进展中起着重要的作用[18]。在衰老过程中,受损的肾脏PPAR信号过表达会加重肾纤维化的发展[19]。结合上述已有的研究结果表明,本研究所预测的信号通路异常表达与CKD发生发展密切相关,针对上述信号通路开展靶向治疗可能具有较好的可行性。

采用STRING及Cytoscape数据库进行CKD关键靶点PPI网络的构建,以寻找靶点的直接、间接调控作用关系,在18个关键靶点及其相互作用蛋白中,度值排名最高的基因为ALB,排名最低的基因为ACSF2,其中仅FLT3为上调基因,其余17关键靶点均为下调基因。再由中药复方网络进一步得到了CKD的DEGs和预测药物共同靶点:PTGS2、ATF3、GPT2。有研究表明,在肾衰竭期间,PTGS2mRNA和蛋白质水平及酶活性一起增加。此外,PTGS2表达的变化与血压、尿量、蛋白质的增加及尿渗透压降低有关[20]。ATF3参与细胞应激反应的复杂过程,一项体外研究表明,MCP-1在上皮细胞中的表达和巨噬细胞的迁移受到含有上皮来源ATF3mRNA的外泌体所抑制,并且在这些外泌体表达后肾脏缺血/再灌注诱导的肾损伤减弱[21];近期另一项研究提示白蛋白诱导肾小管细胞中内质网应激的特征与ATF3/ATF4活化相关,ATF3和ATF4诱导通过改变转录来下调Klotho,消除了增加的蛋白质[22]。GPT2在许多组织中的糖异生和氨基酸代谢中起作用,包括骨骼肌,肾脏和肝脏。最近的研究发现GPT2在人AML细胞HL60中参与肿瘤细胞的增殖、周期分布以及细胞的凋亡,GPT基因的敲减会导致肿瘤细胞的增殖抑制以及凋亡增加[23]。

通过symMap数据库对靶向作用于CKD致病基因的中药进行筛选,并进一步通过TCMSP预测最有可能治疗CKD的天然小分子药物:柠檬酸、香豆雌酚,其来源于大黄、芦荟、虎杖、葛花等中药。在最近的几项研究中发现,柠檬酸可减少肠道中病原微生物负荷,从而改善肠道菌群功能[24],CKD患者由于毒素在体内的蓄积,破坏了肠道上皮功能,激活了肠道的免疫调节,使得有害物质入血,诱导全身性的病变,最终损害肾脏,形成恶性循环[25],而柠檬酸通过稳定肠道菌群,减少肠源性尿毒素的蓄积,延缓CKD进展,发挥肾脏保护的作用。近些年香豆雌酚在多种疾病中展现出药用潜力,其表现出广泛的药理活性,包括抗炎、器官保护、抗氧化等[26];有研究表明香豆雌酚对CKD具有保护作用,能够抑制雌激素受体β阳性细胞,从而影响肾脏组织某些生物酶的活性,促进肾小球系膜细胞增殖、炎症、细胞外基质积聚以及肾间质纤维化。最后通过分子对接验证的通过铁死亡机制治疗CKD的关键活性成分与关键靶点间具有良好的结合活性。

综上所述,本研究通过生物信息学分析得到了从铁死亡角度治疗CKD的靶点及天然药物成分,为今后阐明天然药物成分对基因间的调控机制、协助预防和治疗CKD提供关键的参考依据和数据支撑,也为后续更深入研究CKD的中医药疗法奠定前期基础。