萘酰亚胺衍生物的合成及在水相中检测苦味酸

龚慧媛，穆叶舒，洪 琛，罗 稳*,王超杰

(1. 河南大学 天然药物与免疫工程重点实验室，河南 开封 475004； 2. 河南大学 药学院，河南 开封 475004；3. 河南大学 淮河医院，河南 开封 475004)

芳香族硝基炸药由于稳定性好、敏感度较低、成本低廉等优点，是目前用量最大、用途最广的单质类炸药，它们在为人类文明的发展做出巨大贡献的同时，也对人类的公共安全、生命健康和自然环境产生了严重的危害[1-3]。在这类炸药中，2,4,6-三硝基甲苯(TNT)和2,4,6-三硝基苯酚(PA，又称苦味酸)的应用最为广泛，其中PA的爆炸性比TNT强，同时在染料工业，制药和实验室中也具有重要作用[4]。PA也因此在自然界中大量残留，从而导致环境污染和健康危害。PA的水溶性比TNT好，更利于生物体的吸收而引发疾病[5]。因此，为了防止恐怖威胁和环境污染，开发快速便捷的检测PA的方法，是许多科研工作者关注的重点。

检测硝基芳烃爆炸物的方法有很多，如液/气质联用、红外光谱法、拉曼光谱、和电化学法等[6]，它们耗时长，成本高，且受限于仪器，不能方便地用于现场和实时检测。相比之下，荧光传感法具有操作简单、高灵敏度和快速响应等优点受到广泛关注[7]。荧光传感法需要用到荧光分子，其中有机荧光纳米粒子(FONs)因其制备简单和低成本，且具有良好的生物相容性，更有应用潜力[8]。虽然近年来关于FONs的研究已经取得了一些进展[9]，但开发用于水相检测的有机小分子仍是一个非常具有挑战性的任务[10]。因为传统的有机荧光小分子在水溶液中容易发生“聚集引起的猝灭”(ACQ)。唐本忠院士报道的“聚集诱导发光”(AIE)[11]小分子为在水相中荧光检测提供了可能。

萘酰亚胺是一类具有重要功能的小分子，在医药、生物、化学和材料等领域有广泛应用。例如安奈菲特、米托萘胺和依利奈法德(图1，A ～ C)曾进入临床试验治疗肿瘤[12]。化合物D ～ E具有胆碱酯酶抑制活性[13,14]，而F ～ G作为荧光探针用于检测金属离子和生物分子等[15]。本课题组曾报道了一些靶向细胞亚器和抑制胆碱酯酶活性的萘酰亚胺衍生物[16,17]，具有较强荧光(图1, H ～ I)。本文报道了一种萘酰亚胺衍生物Npd用于检测水相中PA。Npd是典型的受体(A)-供体(D)型分子。1,8-萘酰亚胺单元为电子受体，哌啶单元组成电子供体，形成的分子内电荷转移(ICT)导致其荧光发射。而PA可以使Npd质子化，导致其与PA阴离子之间发生了强静电相互作用，阻碍了ICT效应，导致荧光淬灭。Npd的合成路线如图2所示。

图1 萘酰亚胺类衍生物的结构式

图2 探针Npd的合成路线

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

WFH2204B型手提式紫外灯；X-6型显微熔点仪(温度未校正)； Bruker DPX-300型超导核磁共振仪，TMS为内标；Esquire3000型质谱仪；1260-6230型高精度飞行时间质谱仪；岛津LC-20AB高效液相色谱仪；爱丁堡FS5型荧光光谱仪。

1-叔丁氧羰基-4-(氨基甲基)哌啶(纯度97%)和4-氟苄溴(纯度97%)购自上海阿拉丁试剂公司；TNT甲醇溶液(1.00 g/L)和DNT甲醇溶液(1.00 g/L)购自麦克林试剂公司； PA的乙腈溶液(0.1 g/L)购自德国DRE公司；其他试剂均为市售分析纯，未做进一步处理；硅胶(200～300目)购自青岛海洋硅胶厂。

1.2 化合物的合成

1.2.1 中间体2的合成

将1,8-萘二甲酸酐(1，1.0 mmol)与1-叔丁氧羰基-4-氨甲基哌啶(0.22 g，1.0 mmol)加入到15 mL无水乙醇中，80 ℃ 加热搅拌5 h，反应完毕后，冷却至室温并蒸干溶剂。残余物中加入20 mL氯仿，用2 mol/L的稀盐酸洗涤三次，每次15 mL。取有机相，无水Na2SO4干燥，蒸干溶剂，得0.34 g白色固体，产率85%。

1.2.2 中间体3的合成

将中间体2(2.0 mmol)加入到无水乙醇(10 mL)中，冰浴冷却下缓慢加入4 mol/L的氯化氢的二氧六环溶液(5 mL)，搅拌1 h后撤去冰浴，自然升至室温，搅拌反应过夜。减压蒸除溶剂，硅胶柱层析(V二氯甲烷∶V甲醇= 20∶1)得0.48 g白色固体，产率82%。1H NMR (300 MHz, D2O)δ7.67 (s, 2H, Ar-H), 7.64 (s, 2H, Ar-H), 7.22 (t,J= 7.8 Hz, 2H, Ar-H), 3.55 (d,J= 6.6 Hz, 2H, NCH2), 3.39 (d,J= 12.9 Hz, 2H, CH2), 2.90 (t,J= 12.6 Hz, 2H, CH2), 1.89～1.74 (m, 3H, CHCH2), 1.51～1.38 (m, 2H, CH2); HRMS calcd for C18H18N2O2[M+H]+295.144 7, found 295.146 1。

1.2.3 探针Npd的合成

将中间体3(2.0 mmol)、4-氟苄溴(2.0 mmol)和无水K2CO3(4.0 mmol)加入到乙腈(30 mL)中，60 ℃反应6 h。冷却后过滤，滤饼用乙腈洗涤3次。合并滤液，浓缩，剩余物用硅胶柱层析(V二氯甲烷∶V甲醇= 30∶1)分离，得0.15 g淡黄色固体，产率60%，mp: 128～130 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.57 (d,J= 7.2 Hz, 2H, Ar-H), 8.19 (d,J= 8.1 Hz, 2H, Ar-H), 7.73 (t,J= 7.8 Hz, 2H, Ar-H), 7.24 (t,J= 7.2 Hz, 2H, Ar-H), 6.95 (t,J= 8.7 Hz, 2H, Ar-H), 4.12 (d,J= 7.2 Hz, 2H, CH2), 3.42 (s, 2H, CH2), 2.84 (d,J= 11.4 Hz, 2H, CH2), 1.91 (t,J= 11.1 Hz, 3H, CH, CH2), 1.68 (d,J= 12.3 Hz, 2H, CH2), 1.56～1.42 (m, 2H, CH2);13C NMR (75 MHz, CDCl3)δ164.5, 163.5, 160.3, 134.20, 133.9, 131.6, 130.9, 130.5, 128.2, 127.0, 122.6, 115.1, 114.8, 62.35, 53.3, 45.3, 35.1, 30.1; HRMS calcd for C25H23FN2O2[M+H]+403.182 2, found 403.182 9。Purity: 98% by HPLC。

1.2 紫外和荧光光谱

称取一定量的Npd或检测物，加入DMSO或超纯水，混匀配置成10 mmol/L的储备液，然后分别向一系列离心管中加入计算量的Npd储备液和检测物储备液，并用超纯水稀释到测试浓度，摇匀后静置15 min，加入到石英比色皿中，记录紫外-可见吸收光谱和荧光光谱。

1.3 试纸制备测

普通定性圆形滤纸(直径为2 cm)用20 μmol/L的Npd溶液浸泡3 h，取出后真空干燥，玻璃板压平备用。市售PA溶液，蒸干后加入少量超纯水溶解，稀释到待测浓度备用，用直径为0.3 mm的薄层层析(TLC)点样毛细管轻轻沾取样品，迅速点至试纸上，吹干后在紫外灯下观察拍照。

1.4 细胞毒性

采用噻唑蓝(MTT)法测试化合物对细胞生存率的影响。取对数生长周期的细胞株，调整细胞数为5×103个/mL加入到96孔板中，随后在培养板中加入不同浓度的化合物，每个浓度4个复孔，在37 ℃ 的含5%CO2的恒温箱中培养48 h。然后，每孔加入50 μL MTT溶液(1 g/L)，继续孵育4 h。除去上清液后，加入100 μL的DMSO在室温下溶解晶体产物15 min。用酶标仪测量在570 nm的吸光度。由公式: 抑制率=(A对照-A样品)/(A对照-A空白)×100% 来计算不同浓度的抑制率，实验重复三次，取平均值。

2 结果与讨论

2.1 化合物的合成

以1,8-萘二甲酸酐和1-叔丁氧羰基-4-氨甲基-哌啶为起始原料，在无水乙醇中加热回流生成中间体2，此步不用柱层析分离，可直接进行下一步。中间体2经稀盐酸脱保护生成中间体3，快速柱层析后可得纯品，产率较高。3与4-氟溴苄在碳酸钾的作用下发生亲核取代反应，得到目标产物Npd。其结构通过1H NMR、13C NMR及HRMS确证，纯度通过HPLC测定。

2.2 光学性质

由紫外吸收和荧光光谱(图3a、b)可以看出，室温下Npd在不同溶剂中的吸收带位于340 nm，其在纯水中的荧光最大发射波长为400 nm，肉眼可见蓝色荧光，有机溶剂中荧光较弱。由于Npd易溶于有机溶剂，不溶于水，通过向Npd的THF溶液中加入不同比例的水(fw)来评价其AIE性质。从图4a可以看出，随着fw增加，体系的紫外吸收逐渐降低，表明体系中溶解的Npd逐渐减少，同时最大吸收发生了红移且变宽，表明分子间距变小，共轭程度增加，发生了聚集。由图4b和图5可以看到，394 nm处的荧光强度随着水的含量增高而明显增强，这一现象符合AIE分子的特征。

图3 Npd (20 μmol/L)在不同溶剂中的紫外(a)和荧光(b，λex= 340 nm，slit: 2.0/0.5 nm)光谱

图4 Npd在THF/水混合溶剂中的UV(a)和FL (b，λex= 340 nm，slit: 2.0/0.5 nm)光谱

图5 Npd (20 μmol/L)在 394 nm处的荧光强度与THF/水混合溶剂中的水比例的关系。 插图：紫外灯(365 nm)下的照片

由于Npd可能在水相中发生聚集形成纳米颗粒，因此其溶液应具有丁达尔现象。用激光笔照射不同水比例的Npd溶液(图6)，可以看到在纯THF中(fw=0%)红色光带几乎不可见，随着fw增高，红色光带越来越明显，表明Npd在水中形成了纳米颗粒。经激光粒度仪测试纯水中Npd的平均粒径为164.2 nm。

图6 Npd (20 μmol/L)在不同比例的水/四氢呋喃溶液中的丁达尔效应

AIE分子溶液的荧光会随着浓度增大而增强，不会出现聚集导致的淬灭现象。其原因是分子间距随浓度增大而减小，导致分子内旋转受限，受到激发后非辐射跃迁减少，荧光更强。用THF配置不同浓度的Npd溶液，在紫外灯下(365 nm)肉眼观察(图7a)，发现Npd随着浓度增大(1 μmol/L～200 mmol/L)其溶液荧光明显增强。另外，Npd的固体粉末在紫外灯下也发出明亮荧光(图7c)。

图7 Npd 在(a) THF中紫外灯 (365 nm)下的照片，浓度从左到右依次为：1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L，(b) 日光和 (c) 紫外灯 (365 nm)

2.3 PA识别

往Npd的水溶液中加入PA后记录紫外和荧光的变化，结果如图8所示，加入PA后，340 nm处的紫外吸收明显升高，且肉眼可见溶液颜色由无色变为淡黄色。荧光强度在加入PA后显著降低，加入200 μmol/L的PA后荧光猝灭效率为99.9%。荧光静态猝灭常数Ksv是评价传感器的重要因素，可根据Stern-Volmer方程：I0/I= 1 +Ksv[Q]，计算得到。其中I0和I分别是在未加和加入检测物时的荧光强度，Ksv是猝灭常数，Q是检测物的浓度。根据方程计算得到猝灭常数Ksv的值为3.93×104M-1。根据检测限值(LODs)= 3SB/m，其中SB为空白测量值的标准偏差，m为荧光强度与样品浓度的斜率(图9)。PA浓度在0 ～ 60 μmol/L范围内，识别具有较好的线性关系(R2=0. 99)，经计算LODs值为2.09×10-6mol/L，与其他文献报告的值相近[18-21]，然而这些文献报道的都是在非水或少量水溶液中进行检测的，限制了它们的实际应用。

图8 Npd (20 μmol/L)随PA (0～200 μmol/L) 浓度的变化的UV (a) 和FL (b) 光谱插图(b)：随着 PA 浓度的增加，Npd的FL强度 (391 nm) 变化

图9 Npd与PA识别的线性关系图

由于在实际生产过程中会不可避免地接触到PA，导致PA少量残留，因此有必要开发一种简单快速、低成本的检测方法。我们将滤纸浸入到Npd溶液中并干燥压平，制作了一种可用于PA快速检测的试纸。未浸泡的滤纸在365 nm紫外灯下无荧光，而浸泡过的有明亮蓝色荧光。用毛细管沾取含有PA的溶液，迅速点至试纸上，吹干后在紫外灯下观察，肉眼可分辨的最低浓度为0.50 mmol/L(图10)，优于文献报道[22]。

图10 Npd试纸对水中PA的快速检测

2.4 对PA的选择性

为了考察Npd对PA识别的选择性，选取了常见的爆炸物如TNT、DNT、硝酸甘油(NG)以及硝基苯(NB)等进行了选择性实验。向Npd溶液(20 μmol/L)中加入40 μmol/L的待测物，PA组的荧光强度降低超过了60%，而加入其它待测物荧光降低小于20%，表明Npd对PA有选择性响应(图11a)。为了进一步验证Npd对PA识别的抗干扰性，在过量的干扰物(40 μmol/L)存在下，测试了Npd(20 μmol/L)和PA(40 μmol/L)体系的荧光强度(图11b)。图中显示，在干扰物存在下，加入PA后体系的荧光强度仍明显降低，表明Npd对PA的识别受其它爆炸干扰物的影响较小。

图11 Npd对PA的选择性(a)和抗干扰性(b)

2.5 机理研究

采用1H NMR研究Npd对PA的识别机理。由于市售PA溶液价格昂贵且含量较低(0.1 g/L)，因此我们用对硝基苯酚代替PA。在Npd的CDCl3溶液加入对硝基苯酚后，a位置的质子信号向高场位移了0.05，f位置向低场位移了0.05，g位置向低场位移了0.79，(图12)，表明对硝基苯酚使Npd发生质子化，两者发生了强静电作用，阻碍了Npd分子的ICT效应，导致其荧光淬灭。

图12 探针Npd的识别机制

2.6 Npd的细胞毒性

采用MTT法测试了Npd对人肝癌细胞HepG2、人正常肝细胞HL-7702、人神经母瘤SH-SY5Y、人结肠癌细胞HT29和人宫颈癌细胞Hela的体外抑制率，米托蒽醌(Mito)作为阳性对照，结果见表1。在1 μmol/L和10 μmol/L浓度下，除了SH-SY5Y和Hela细胞外，Npd对五种细胞的抑制率均小于5%; 在50 μmol/L浓度时，抑制率较弱，在20%～30%之间; 在高浓度(100 μmol/L)下，细胞抑制率仍低于50%; 值得注意的是，Npd对正常肝细胞抑制率小于癌细胞。阳性对照米托蒽醌在10 μmol/L浓度下对细胞的抑制率均大于65%，以上结果表明Npd的体外细胞毒性较低。

表1 化合物Npd对细胞的体外抑制率(%，n=3)

3 结论

设计合成了一个萘酰亚胺衍生物Npd荧光探针并进行了结构表征和功能评价。结果表明，Npd是一种AIE分子，能够在水溶液中对PA进行检测，其机制为PA的酸性使萘酰亚胺上的羰基质子化，阻断了Npd的ICT发射，导致荧光发生淬灭。该探针检测限为2.09×10-6mol/L，对PA的识别不受其他爆炸物的干扰，且细胞毒性较低，能够制备成试纸对PA进行简便快速定性检测，具有潜在的应用前景。