2022年上半年我国主要家禽养殖地区常见疫病的病原检测与结果分析

朱巧艳，李丛丛，肖亚朋，贾然洁，高彬文，赵坤坤，张盼涛*

（1. 洛阳中科基因检测诊断中心有限公司，河南 洛阳 471000；2. 北京中科基因技术股份有限公司，北京 102600）

我国是世界上养禽大国，疫病的发生与流行是制约我国家禽养殖业可持续发展的关键因素之一，同时对食品安全、生态环境造成严重危害。科学有效地防控畜禽疫病是我国养殖业可持续发展的重大需求。2022年上半年洛阳中科基因检测诊断中心有限公司对我国主要家禽养殖地区送检样品进行疫病的检测诊断或感染状态监测，对检测结果进行总结分析。该检测结果对我国家禽疫病流行趋势分析、疫病防控策略的制定提供临床数据，具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 病料与试验动物

2022年1～6月，洛阳中科基因检测的鸡、鸭、鹅组织病料样品主要来自于辽宁、山东、河南、河北、江苏、湖北、山西、江西、广东和广西等主要家禽养殖地区。

SPF鸡种蛋购自济南斯帕法斯家禽有限公司，由洛阳中科基因检测诊断中心有限公司孵化至适宜日龄用于H9亚型AIV、IBV和IBDV的分离。

1.2 主要试剂和引物

磁珠法核酸提取试剂盒，购自济凡生物科技（北京）有限公司；PCR和RT-PCR相关试剂购自北京全式金生物技术股份有限公司；引物合成和基因测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。本研究中使用的PCR和RT-PCR鉴定引物，以及病原目的基因扩增引物，由洛阳中科基因检测诊断中心有限公司参考世界动物卫生组织、中华人民共和国国家标准、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准、中华人民共和国农业行业标准进行合成、保存。

1.3 病料处理与分子鉴定

针对病毒性疫病，根据检测项目选取对应的组织，按文献报道的方法将组织剪碎后研磨成匀浆，按照1:5的比例加入含双抗（青霉素 10 000 U/mL、链霉素2 000 U/mL）的灭菌PBS，-20 ℃反复冻融3次后置于4 ℃作用4 h，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，收集上清液，-20 ℃保存[1]。取200μL上清液，按照磁珠法核酸提取试剂盒说明书，利用全自动核酸提取仪进行核酸提取。对提取后的核酸按照洛阳中科基因检测诊断中心有限公司建立的方法，对病料样品进行病原分子鉴定。

1.4 病毒分离与遗传进化分析

对1.3中分子鉴定为阳性的H9亚型AIV、IBV、IBDV病料研磨离心获得的上清液接种SPF鸡胚进行病毒分离。H9亚型AIV和IBV病毒分离时，按文献报道的方法将上清液按照0.2 mL/枚的剂量，尿囊腔途径接种9～11日龄的SPF鸡胚，置于37 ℃孵化箱孵育观察至120 h，收获接种后24～120 h死亡鸡胚及120 h存活鸡胚的尿囊液[1-2]。IBDV病毒分离时，接种途径为鸡胚绒毛尿囊膜，接种后弃去24 h内死亡的鸡胚，收获接种后24～120h死亡鸡胚及120 h存活鸡胚的尿囊液、绒毛尿囊膜，-20 ℃反复冻融3次后4 ℃、3 000 r/min离心10 min，收集上清液[3]。

对分离的H9亚型AIV、IBV和IBDV病毒按前述方法提取核酸，分别扩增HA基因全长、S1基因、VP2基因，RT-PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，使用Lasergene软件对测序结果进行处理和编辑。根据GenBank上发表的相关毒株序列，使用Mega 6.0软件分别对HA基因、S1基因、VP2基因进行遗传进化分析。

1.5 细菌分离与鉴定

针对分离的不同致病菌采集对应的样品，按常规无菌操作划线接种于TSA和麦康凯平板，5%CO2培养箱37 ℃倒置培养24 h，观察结果。挑取单个菌落进行革兰氏染色，显微镜下观察形态[4]。形态学无法确定细菌种、属时，进一步通过生化鉴定或16s基因测序进行确定。

1.6 肿瘤性疾病的病理组织学观察

针对肿瘤性疾病，结合临床症状选择对应的组织脏器，按照常规方法进行取材固定、脱水透明、浸蜡包埋、切片烤片、脱蜡染色等步骤进行HE染色、观察，确定肿瘤性疾病的种类[5]。

2 结果与分析

2.1 鸡病毒病检测结果

2022年1～6月共检测送检的鸡病料6 087份，开展H9亚型AIV、IBV等17种病原的检测。送检样品中，检测样品数量最多的病原分别为鸡白血病（ALV）、H9亚型AIV、IBV、鸡新城疫病毒（NDV）、I群禽腺病毒（FAdV-I）和鸡传染性贫血病毒（CIAV），而检出率最高的病原分别为IBV、鸡马立克氏病病毒（MDV）、IBDV、H9亚型AIV、CIAV、鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV），阳性率分别为41.03%、39.08%、25.00%、20.36%、20.31%、18.29%。FAdV-I、禽呼肠孤病毒（ARV）、REV虽有一定的送检量，但检测阳性率均小于10%。而禽脑脊髓炎病毒（AEV）、鸡减蛋综合征病毒（EDSV）、鸡痘病毒（FPV）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）2022年上半年送检量较少，并且检测均为阴性。上述检测结果表明，由IBV、H9亚型AIV、ILTV引起的呼吸道疫病和由CIAV和IBDV引起的免疫抑制病依然是目前鸡群疫病防控的重点和难点。MDV检测的阳性率高达39.08%，结合样品背景和阳性样品Meq基因测序结果，这些阳性样品中26/34（76.47%）为疫苗株，说明目前临床中使用的MDV相关活疫苗整体防控效果较为理想。

另外，样品检测中发现，禽偏肺病毒（aMPV）和禽戊型肝炎病毒（aHEV）虽有一定的送检量，但均未检出。该检测结果与相关文献报道的高抗体阳性率不一致[6，7]。分析原因，可能是aMPV和aHEV单独感染引起的症状较轻微，需要与其它病原混合感染才能表现出明显的临床症状，此时采样检不出或检出率极低[8-10]。针对这两种疫病，目前没有商品化的疫苗可以使用，应做好生物安全防控。 2022年上半年鸡病毒检测结果统计见表1。

表1 2022年上半年鸡病毒检测结果统计

2.2 H9亚型AIV、IBV和IBDV遗传进化分析

对2022年上半年分离的H9亚型AIV、IBV、IBDV进行测序，测序的靶基因分别为HA基因、S1基因、VP2基因，根据测序结果构建进化树进行遗传进化分析。

对55株H9亚型AIV的HA基因进行测序，HA基因核苷酸遗传进化分析结果表明，55/55均属于欧亚谱系的h9.4.2.5分支，其中54/55属于9.4.2.5a分支毒株，1/55属于9.4.2.5b分支毒株，表明9.4.2.5分支毒株为目前临床优势流行毒株，与文献报道一致[11-12]。分离株遗传进化分析见图1。55株分离株之间的同源性为91.5%～100%，而与国内常用的疫苗株SS株和F株之间的同源性均较低，仅为86.7%～89%，核苷酸的突变会导致氨基酸的变化，表明现有疫苗对鸡群的免疫保护效果有限，在持续的免疫压力下，促使H9亚型AIV病毒不断的发生变异。

图1 2022年上半年H9亚型AIV分离株HA基因遗传进化分析（三角标记为本研究分离毒株）

对41株IBV的S1基因进行测序，遗传进化分析结果表明，29/41属于QX-Like分支毒株，6/41属 于4/91-Like分 支 毒 株，4/41属 于Mass-Like分支毒株，1/41属于TW Ⅰ型分支毒株，1/41属于基因Ⅵ型分支毒株，QX型IBV依然是优势流行分支，其次为4/91-Like和Mass-Like型分支毒株，与现有文献报道基本一致[13]。分离株遗传进化分析见图2。临床中多种IBV基因型共同流行，商品化的活疫苗也有多种，但IBV基因型之间交叉保护效果有限，个别基因型活疫苗存在安全性隐患，使用时应慎重。针对IBV的防控，临床生产数据表明，采用安全性好的IBV活疫苗进行基础免疫，利用灭活疫苗进行加强免疫的策略可取得良好的免疫效果。

图2 2022年上半年IBV分离株S1基因遗传进化分析（三角标记为本研究分离毒株）

对分离的14株IBDV VP2基因进行测序，遗传进化分析结果表明，12/14属于变异株，2/14属于超强毒株[14]，分离株遗传进化分析见图3。针对IBDV的防控，目前有商品化的全病毒灭活疫苗、亚单位疫苗、重组病毒活载体疫苗、致弱活疫苗和抗原抗体复合物，从临床应用效果来看，这些疫苗对超强毒株和经典株的防控效果较为理想，但是针对变异株并未能提供有效保护，建议养殖企业选用针对变异株保护效果更佳的疫苗。

图3 2022年上半年IBDV分离株VP2基因遗传进化分析（三角标记为本研究分离毒株）

2.3 水禽病毒病检测结果

2022年1～6月本实验室共检测送检的水禽病料262份，开展鸭圆环病毒（DuCV）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）等8种病原的检测。送检样品中，检测样品数量最多的病原分别为H9亚型AIV、NDRV、DHAV、ASTV，而检出率最高的病原分别为DuCV、DTMUV、鸭病毒性肝炎病毒（DHAV）、鹅/番鸭细小病毒（GPV/MDPV）、鹅星状病毒（GoAstV），阳性率分别为57.14%、40.00%、30.30%、26.32%、17.65%，这几种病毒病依然是长期困扰水禽养殖业的重要疫病，见表2。

表2 2022年上半年水禽病毒病检测结果统计

2.4 家禽细菌病检测结果

2022年上半年，本实验室对送检禽病样品1 085份进行了大肠杆菌、副鸡禽杆菌、沙门氏菌、滑液囊支原体、鸡毒支原体、鸭疫里默氏杆菌等病原的检测（表3），其中大肠杆菌、沙门氏菌、副鸡禽杆菌、滑液囊支原体、鸡毒支原体、鸭疫里默氏杆菌的检测量较大，且大肠杆菌、沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、滑液囊支原体检出率较高，需重点关注；虽然链球菌与葡萄球菌的送检量不太大，但是检出率均为100%需特别关注，详见表3。细菌性疫病有其地方流行性，因此要结合本地的流行情况提前做好防控。

表3 常见细菌病检测结果统计

2.5 肿瘤病诊断结果

家禽的肿瘤病主要为网状内皮组织增生病、禽白血病和马立克氏病，对于这些肿瘤病来讲，常规的病毒学和血清学方法在临床诊断中缺少价值，主要采用病理学的方法进行诊断。MDV感染可导致组织发生多种淋巴细胞浸润，增生细胞为多形性的成熟或不成熟的淋巴细胞，H.E染色时淋巴细胞细胞核蓝染。ALV感染主要引起大淋巴细胞、成红细胞、成髓细胞、髓细胞不同形态聚积或浸润，肿瘤细胞由聚集的大淋巴细胞组成，细胞多处于相同的发育阶段，肝脾结节周围有一层成纤维细胞样细胞，髓细胞在H. E染色时表现为胞质红染。而REV的典型病变为实质细胞坏死和网状细胞增生。基于MDV、ALV、REV感染后引起的组织学差别可进行病理学鉴别诊断。

2022年上半年病理学肿瘤病诊断样品301份，其中鸡马立克氏病48份，均未检出；禽白血病检测164份，阳性占比26.8%（44/164）；禽网状内皮组织增生症检测89份，阳性占比25.8%（23/89）。禽肿瘤病的检出率一直处于较高水平，对于肿瘤病的控制要从种源抓起，关于白血病及网状内皮组织增生病的净化时刻不能放松[15]。

3 讨论

2022年上半年实验室检测数据显示，禽病毒性疾病检出率较多的病原为H9亚型AIV、IBV、IBDV、CIAV、MDV和水禽的DHAV、DuCV、GPV/MDPV、NDRV。疫苗免疫是防控疫病的有效措施之一，病毒性疫病的防控应坚持“预防为主、防治结合”的策略。根据养殖场具体情况制定合理的免疫程序，同时应结合当地优势流行分支毒株选用抗原性匹配好的疫苗，避免盲目使用疫苗。某些种类的活疫苗免疫后副反应大，疫苗毒株安全性较差，免疫后带毒时间长，存在毒力返强的风险，因此应慎重选择活疫苗。同类型的活疫苗不易混合使用，避免毒株之间基因重组，形成新的流行毒株。

为了保证食品安全，避免抗生素滥用导致的日益严峻的细菌耐药性问题，我国近年来出台了一系列减抗、限抗、禁抗相关政策。这就要求针对细菌性疾病的诊断检测必须准确，结合药敏试验的结果联合用药进行防控。饲养过程中应加强设施建设、优化饲养环境，避免或降低应激反应，做好环境的消毒、强化卫生条件，做好饮水和饲料检测，避免病从口入。同时，做好病毒性疫病的防控，降低继发细菌病的风险。

由ALV、REV、MDV引起的肿瘤性疫病严重危害养禽业的发展，这三种肿瘤性疾病世界各地均有流行。疫苗免疫是迄今为止预防MD的有效措施之一，免疫效果好，成本低。AL和RE目前尚无有效的疫苗和治疗方法，须从种鸡群净化入手。另外，对活疫苗应加强检测，避免因为疫苗污染外源病毒导致这三种肿瘤性疾病的流行。

临床流行的诸多疫病，目前仍然无商品化疫苗可应用于临床，应加强禽群饲养管理和清洁、消毒、垫料管理等生物安全管理，及时淘汰感染动物，防止疫病扩散、流行。