黄芪总皂苷通过激活Nrf2/HO-1 信号通路缓解L-精氨酸诱导的小鼠急性胰腺炎氧化损伤的研究

2022-09-15周文勇

现代中药研究与实践 2022年3期

王欣，周文勇，孙月

（1. 沧州中西医结合医院普外科，河北沧州 061000； 2. 沧州市中心医院肝胆外科，河北沧州061000；3. 沧州市人民医院普外科，河北沧州 061000）

急性胰腺炎（Acute pancreatitis, AP）是常见消化系统急腹症疾病之一，临床症状多为剧烈腹胀腹痛、恶心、呕吐、发热等，严重者伴有胰腺出血、感染、坏死或休克等并发症，其发病率逐年升高，病死率更是高达20%[1]。但因AP 发病机理和病理学尚不明确，所以临床缺乏有效治疗方案，多以开腹手术治疗为主。研究表明，氧化应激反应在AP 发病机制中起重要作用，抗氧化反应和清除自由基也成为研究临床治疗AP 的重点[2]。黄芪是豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，具有益气补中、升阳固表、利尿生肌等功效，中医临床多用于治疗气血不足、中气下陷、食欲减退、久泻脱肛等[3-4]。皂苷是其主要活性成分之一，现代药理学研究发现其对抗氧化应激反应具有良好效用，可以调节氧化反应酶系和清除自由基等[5]。因此，本研究旨在通过建立AP 小鼠模型，探讨黄芪总皂苷对AP 小鼠氧化损伤的影响及其可能作用机制，为黄芪总皂苷药物开发及AP临床治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6 ～ 8 周龄SPF 级健康雄性C57BL/6 小鼠80 只，体质量为18 ～ 22 g。动物来源：广东省实验动物检测所，生产许可证号：SCXK（粤）2018-0044。所有小鼠于相同环境进行适应性饲养7 d，试验期间进食普通饲料，可自由饮水。环境温度调节范围为22 ～ 24℃，环境相对湿度调节范围为40% ～60%，环境光暗周期为光照12 h、黑暗12 h。

1.1.2 药品、主要试剂和仪器黄芪总皂苷（批号：A52540，纯度≥98%，规格：20 mg，上海吉至生化科技有限公司）；L-精氨酸粉剂（批号：R003157，纯度≥99%，规格：100 g，上海易恩生物科技有限公司）；血清淀粉酶（AMY）ELISA 试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）（南京建成生物工程研究所）；兔抗β-actin 多克隆抗体、兔抗鼠核因子E2 相关因子2（Nrf2）、血红素加氧酶1（HO-1）多克隆抗体、山羊抗兔二抗IgG（美国CST 公司）；Stat Fax2600型多功能洗板机（美国AWARENESS 公司）；WD-2102 型自动酶标仪（上海惠诚生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 AP 小鼠模型建立适应性饲养7 d 后禁食12 h，随机选取65 只小鼠建立AP 模型，每间隔1 h 给予小鼠腹腔注射pH = 7，20% L-精氨酸溶液（生理盐水配制）2.5 mg/kg，连续注射2 次。末次给药后，观察小鼠行为，若小鼠表现为腹部收缩明显，痛苦异常，且伴有间歇性呕吐，采集小鼠尾静脉血液，若AMY 水平较对照组小鼠相比呈倍数增加，则视为建模成功[6]。

1.2.2 分组与给药建模成功小鼠（60 只）随机分为模型组（15 只）、黄芪总皂苷低剂量组（15 只）、中剂量组（15 只）、高剂量组（15 只），其余小鼠为对照组（15 只）。参考文献[7-8]用量，黄芪总皂苷低、中、高剂量组灌胃给药25、50、100 mg/kg 黄芪总皂苷混悬液（生理盐水配制），对照组及模型组给予等量生理盐水，各组给药1 次/d，连续7 d。

1.3 检测指标

1.3.1 样本采集各组小鼠末次给药后6、12、24 h 采集尾静脉血液，于4 ℃以3 000 r/min 离心15 min，分离血清，-20℃保存。采集完毕，各组小鼠称重，腹腔注射2%戊巴比妥钠40 mg/kg 麻醉，开腹，采集小鼠腹主动脉血液，静置血液4 h，以3 000 r/min 离心15 min，分离血清。处死小鼠，冰上剥离小鼠胰腺组织，称量胰腺质量并计算胰腺指数[胰腺指数（%） = （胰腺湿重/小鼠体质量）×100%]，再用预冷的生理盐水多次冲洗，将胰腺组织分为两部分，一部分胰腺组织使用4%多聚甲醛液固定24 h 备用，其余组织装入无菌冻存管内，-80 ℃保存备用。

1.3.2 AMY 水平检测取出各时间点采集的尾静脉血液分离出的血清，将ELISA 试剂盒取出并恢复至室温后开始检测。严格按照试剂盒说明书操作，将已知浓度的标准品与待测样品加入微孔酶标板内，再加入提前做好预热的生物素抗体，待完全反应后弃液并清洗板孔，加入提前预热的标记酶，完全反应后再次弃液并清洗板孔，加入底物A、B 出现颜色梯度变化后，终止反应。使用酶标仪测定OD，根据标准品梯度浓度结果建立标准曲线，代入待测样品OD计算样本浓度。

1.3.3 氧化应激因子水平检测取出腹主动脉血液分离出的血清和ELISA 试剂盒，于室温下待试剂盒和待测样品恢复至室温后开始检测，按照MDA、GSHPx、SOD、CAT 试剂盒说明书操作，主要步骤为：将稀释好的标准样品50 μL及待测样品添加至相应板孔中，封膜于37℃恒温水浴箱中静置60 min，清洗板孔 6 次。每孔中加入50 μL 工作液，封膜避光，于37℃恒温水浴箱中静置60 min，清洗板孔6 次。加入显色底物A、B 各50 μL，混匀，37℃反应15 min，加入终止液终止反应。于酶标仪450 nm 测定OD，根据标准品浓度及其OD导出标准曲线，结合待测样品OD计算样品浓度并做好记录。

1.3.4 胰腺组织HE 染色观察将经过4%甲醛固定24 h 的胰腺组织取出，冲洗固定液后，使用从低浓度到高浓度的乙醇溶液对胰腺组织逐步脱去水分，脱水后将组织泡入二甲苯中透明。取出透明好的胰腺组织完全浸入已溶化的石蜡中，包埋后待组织块变硬。对石蜡块修整并切片，切成5 μm 厚度的薄片，再使用二甲苯和乙醇脱蜡复水，苏木素染色15 min，流水冲洗15 min 返蓝，放入1%盐酸乙醇褪色10 s，清水漂洗，不同梯度乙醇溶液脱水，0.5%伊红溶液染色3 min，再浸入二甲苯、不同梯度乙醇脱蜡脱水，用中性树脂封片。阴凉处晾干后，将胰腺组织切片置于光学显微镜下观察分析并拍片。

1.3.5 Nrf2、HO-1 mRNA 表达取出备用的胰腺组织加入EP 管内，再加入RNA iso plus 500 μL，匀浆后静置10 min，依次加入氯仿、异丙醇，离心并弃去上清液，获得总RNA。取2 μL RNA 样品使用超微量核酸蛋白测定仪检测RNA 浓度。测定结束后使用逆转录试剂盒逆转录获得cDNA。加入2 μL cDNA，10 μL SYBRGreen PCR Master Mix，0.8 μL 上、下游引物，6.4 μL RNase Free Water 制备PCR 反应体系。于95℃ 5 s，60℃ 10 s，72℃ 15 s 共进行40 个循环。反应引物序列设计为Nrf-2：上游（5′-TCTTGGAGTAAG TCGAGAAGTGT-3′），下游（5′-GTTGAAACTGAG CGAAAAAGGC-3′）；HO-1：上游（5′-CTTTAGTCAG CGACAGAAGGAC-3′），下游（5′-AGGCATCTTGTT TGGGAATGTG-3′）；β-actin：上游（5′-TAGATGACCAT GAGTCGCTTGC-3′），下游（5′-GCCAAACTTGCTCCA TGTCCGG-3′）。延伸步骤采集荧光信号，反应结束后绘制融解曲线，以ΔCt 值和2-△△Ct进行数据分析，计算待测样品目的基因相对定量结果。

1.3.6 Nrf2、HO-1 蛋白表达先按照比例制备RIPA裂解液，冰上预冷备用，取出备用的胰腺组织加入EP管内，再加入500 μL 裂解液，于4℃以12 000 r/min（r= 12 cm）高速离心机离心10 min，吸取上清液，利用BCA 蛋白测量试剂盒测定组织蛋白浓度。计算出蛋白上样量，将制备好的分离胶和浓缩胶加入垂直电泳槽，恒压80 V，15 min，待蛋白电泳至浓缩胶处，电压120 V，45 min，切胶转模。用TBST 配制5%脱脂奶粉，封闭1 h 后，加入1 ∶2 000 稀释一抗，4℃，摇床慢速孵育过夜，TBST 清洗4 次，加入1 ∶3 000稀释二抗，封闭1 h，TBST 清洗4 次，配制ECL 发光液，滴在PDVF 膜上，置于成像仪内，曝光3 min，获得成像，分析目的条带光密度值。

1.4 统计学方法

用SPSS 23.0 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 胰腺指数比较

与对照组比较，模型组小鼠胰腺指数升高（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪总皂苷低、中、高剂量组小鼠胰腺指数降低（P＜0.05），且随着给药浓度的增加，胰腺指数呈下降趋势（P＜0.05），见表1。

表1 各组小鼠胰腺指数比较（±s, n = 15）Tab. 1 Comparison of pancreatic index of mice in each group（±s, n = 15）

注：与对照组比较，*P ＜ 0.05；与模型组比较，△P ＜ 0.05；与黄芪总皂苷低剂量组比较，▲P ＜ 0.05；与黄芪总皂苷中剂量组比较，#P ＜ 0.05。

组别胰腺指数 / %对照组 3.94 ± 0.32模型组 12.73 ± 1.35*黄芪总皂苷低剂量组 8.49 ± 0.72*△黄芪总皂苷中剂量组 6.58 ± 0.53*△▲黄芪总皂苷高剂量组 4.26 ± 0.36*△▲＃F 340.997 P 0.000

2.2 AMY 水平比较

与对照组比较，模型组小鼠各时间点血清AMY水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪总皂苷低、中、高剂量组小鼠各时间点血清AMY 水平均呈现不同程度的降低（P＜0.05），以高剂量组最为明显。随着时间变化，模型组、黄芪总皂苷低、中剂量组小鼠血清AMY 水平升高（P＜0.05），对照组与黄芪总皂苷高剂量组小鼠血清AMY 水平间差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 各组小鼠不同时间点血清AMY 水平比较（±s, n = 15）Tab. 2 Comparison of serum AMY levels in mice at different time points（±s, n = 15）

注：与对照组比较，*P ＜ 0.05；与模型组比较，△P ＜ 0.05；与黄芪总皂苷低剂量组比较，▲P ＜ 0.05；与黄芪总皂苷中剂量组比较，#P ＜ 0.05。

组别 AMY / （U/L） F P 6 h 12 h 24 h对照组 2 017.69 ± 186.51 2 115.78 ± 150.42 2 162.84 ± 163.47 2.933 0.064模型组 4 673.27 ± 380.32* 5 468.82 ± 430.27* 6 783.47 ± 561.28* 79.258 0.000黄芪总皂苷低剂量组 3 754.06 ± 291.26*△ 4 611.03 ± 384.27*△ 5 362.19 ± 465.34*△ 64.884 0.000黄芪总皂苷中剂量组 2 961.28 ± 239.97*△▲ 3 218.69 ± 254.82*△▲ 4 213.08 ± 367.25*△▲ 76.403 0.000黄芪总皂苷高剂量组 2 349.46 ± 190.85*△▲＃ 2 388.11 ± 209.76*△▲＃ 2 514.24 ± 216.94*△▲＃ 2.621 0.085 F 243.034 336.106 380.371 - -P 0.000 0.000 0.000 - -

2.3 氧化应激因子比较

与对照组比较，模型组小鼠血清MDA 水平升高，GSH-Px、SOD、CAT 水平降低（P＜ 0.05）。与模型组比较，黄芪总皂苷低、中、高剂量组小鼠血清MDA水平降低，GSH-Px、SOD、CAT 水平升高（P＜ 0.05），以高剂量组最为明显，见表3。

表3 各组小鼠氧化应激因子水平比较（±s, n = 15）Tab. 3 Comparison of levels of oxidative stress factors in mice of each group（±s, n = 15）

注：与对照组比较，*P ＜ 0.05；与模型组比较，△P ＜ 0.05；与黄芪总皂苷低剂量组比较，▲P ＜ 0.05；与黄芪总皂苷中剂量组比较，#P ＜ 0.05。

组别 MDA / （nmol/mg） GSH-Px / （U/mg） SOD / （U/mg） CAT / （U/mg）对照组 1.54 ± 0.12 246.43 ± 21.53 328.24 ± 26.37 2.73 ± 0.23模型组 5.62 ± 0.42* 121.82 ± 10.17* 129.42 ± 11.23* 1.06 ± 0.08*黄芪总皂苷低剂量组 4.46 ± 0.39*△ 163.24 ± 13.34*△ 227.05 ± 18.84*△ 1.43 ± 0.12*△黄芪总皂苷中剂量组 3.29 ± 0.28*△▲ 204.96 ± 19.47*△▲ 266.94 ± 22.56*△▲ 1.69 ± 0.15*△▲黄芪总皂苷高剂量组 1.62 ± 0.15*△▲＃ 235.15 ± 20.51*△▲＃ 304.62 ± 24.61*△▲＃ 2.61 ± 0.21*△▲＃F 534.359 130.101 200.102 289.138 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 胰腺组织HE 染色比较

结果显示，对照组小鼠胰腺腺泡结构完整，细胞排列整齐，边界清晰，染色均匀。胰腺组织未见出血、坏死等现象，胰管形态正常，小叶间隙正常，未见炎性细胞浸润。模型组小鼠胰腺细胞形态异常，细胞边界模糊，染色不均。胰腺组织出现细胞水肿，间质可见出血现象。小叶排列散乱无序，可见大量炎性细胞浸润。黄芪总皂苷低、中、高剂量组小鼠胰腺腺泡形态得到改善，细胞界限清晰，染色均匀，细胞水肿变性现象减少，小叶走势整齐，炎性细胞浸润现象显著减少，见图1。

图1 胰腺组织HE 染色结果（×200）Fig. 1 HE staining results of pancreatic tissue（×200）

2.5 Nrf2、HO-1 mRNA 比较

与对照组比较，模型组小鼠Nrf2、HO-1 mRNA表达水平降低（P＜ 0.05）。与模型组比较，黄芪总皂苷低、中、高剂量组小鼠胰腺组织Nrf2、HO-1 mRNA 表达水平均升高（P＜ 0.05），以高剂量组最为明显，见表4。

表4 各组小鼠Nrf2、HO-1 mRNA 水平比较（±s, n = 15）Tab. 4 Comparison of Nrf2 and HO-1 mRNA levels in mice of each group（±s, n = 15）

注：与对照组比较，*P ＜ 0.05；与模型组比较，△P ＜ 0.05；与黄芪总皂苷低剂量组比较，▲P ＜ 0.05；与黄芪总皂苷中剂量组比较，#P ＜ 0.05。

对照组 3.64 ± 0.34 2.73 ± 0.12模型组 1.27 ± 0.13* 0.94 ± 0.07*黄芪总皂苷低剂量组 1.96 ± 0.18*△ 1.35 ± 0.14*△黄芪总皂苷中剂量组 2.46 ± 0.21*△▲ 1.98 ± 0.17*△▲黄芪总皂苷高剂量组 3.58 ± 0.32*△▲＃ 2.52 ± 0.23*△▲＃F 255.207 357.869 P 0.000 0.000

2.6 Nrf2、HO-1 蛋白比较

与对照组比较，模型组小鼠胰腺组织Nrf2、HO-1 蛋白表达水平降低（P＜ 0.05）。与模型组比较，黄芪总皂苷低、中、高剂量组小鼠胰腺组织Nrf2、HO-1 蛋白表达水平均升高（P＜ 0.05），以高剂量组最为明显，见表5、图2。

表5 各组小鼠Nrf2、HO-1 蛋白水平比较（±s, n = 15）Tab. 5 Comparison of Nrf2 and HO-1 protein expression levels in mice of each group（±s, n = 15）

注：与对照组比较，*P ＜ 0.05；与模型组比较，△P ＜ 0.05；与黄芪总皂苷低剂量组比较，▲P ＜ 0.05；与黄芪总皂苷中剂量组比较，#P ＜ 0.05。

组别 Nrf2 HO-1对照组 1.64 ± 0.14 1.37 ± 0.12模型组 0.47 ± 0.05* 0.34 ± 0.03*黄芪总皂苷低剂量组 0.96 ± 0.08*△ 0.65 ± 0.06*△黄芪总皂苷中剂量组 1.26 ± 0.11*△▲ 0.98 ± 0.07*△▲黄芪总皂苷高剂量组 1.58 ± 0.16*△▲＃ 1.25 ± 0.13*△▲＃F 263.542 333.667 P 0.000 0.000

图2 胰腺组织蛋白检测图Fig. 2 Detection of protein in cerebral artery tissue

3 讨论

AP 病程进展中胰腺腺泡受损产生大量氧自由基，超过机体内抗氧化能力，过量氧自由基加重胰腺局部炎症反应，增加毛细血管通透性，损伤血管内皮细胞，释放大量有毒物质最终引起细胞结构、生理和代谢机制调节异常[9]。因此，尽早开发抗氧化药物对AP 临床治疗有重要意义。黄芪总皂苷是黄芪主要有效成分之一，常用来治疗心肌损伤、氧化损伤等[10-11]。研究报道黄芪可以通过减少自由基产生、改善供氧，调节抗氧化酶活性等途径提高机体抗氧化能力，但其作用机制尚不明确[12]。腹腔注射L-精氨酸法诱导AP 模型，病理进程与人类疾病类似，现已被广泛应用于AP 疾病研究以及相应药物开发[13-14]。故本研究腹腔注射L-精氨酸法建立AP 小鼠模型，从分子机制上探讨黄芪总皂苷对AP 小鼠氧化损伤的改善，探究其可能作用机制。结果显示，模型组小鼠胰腺指数、血清AMY、MDA 水平升高，GSH-Px、SOD、CAT 水平降低，提示模型组小鼠抗氧化因子水平降低，氧化/抗氧化系统失衡，小鼠体内存在严重的氧化应激反应。过度的氧化应激对胰腺组织造成损伤，血清AMY 下降，胰腺组织受损严重。在给予不同剂量的黄芪总皂苷干预下小鼠均表现出胰腺指数、血清AMY、MDA 水平降低，血清GSH-Px、SOD、CAT水平升高，且诸项指标以高剂量组效果最佳。提示不同剂量的黄芪总皂苷均可在一定程度上缓解小鼠体内的氧化损伤，提高抗氧化因子水平，减少氧化应激对胰腺组织的损伤，100 mg/kg 黄芪总皂苷对小鼠氧化/抗氧化系统损伤的改善效果最佳。此外，胰腺组织HE 染色结果也表现出胰腺腺泡破损现象得到改善，细胞水肿变性减少，炎性细胞浸润减少，胰腺受损现象得到改善。

Nrf2/HO-1 通路广泛参与机体内各组织器官抗氧化应激损伤，是内源性保护体系之一[15]。Nrf2 是一种与抗氧化应激密切相关的核转录因子，可调节应激状态下细胞氧化还原状态[16]。正常状态下，Nrf2 位于细胞骨架上，并与其阻遏蛋白Keapl 耦联。当受到过量氧自由基、亲电性试剂刺激时，Nrf2 从泛素化降解途径中脱离出来，与抗氧化反应元件结合，启动下游多种抗氧化基因转录，调控与氧化相关抗氧化酶的表达[17]。在本研究中，黄芪总皂苷各剂量组小鼠Nrf2、HO-1 mRNA 和蛋白表达水平较模型组小鼠均明显升高，以黄芪总皂苷高剂量组效果最为明显，结合小鼠血清中抗氧化因子水平变化，可见激活Nrf2/HO-1 信号通路，对AP 小鼠氧化损伤有积极影响。