AS肉鸡肝脏HIF-1α基因的表达与MFB细胞变化关系*

焦垚瑄，李凯，张新楠，杨凯，王尚龙，冯昕炜

（塔里木大学动物科学与技术学院，新疆 阿拉尔 843300）

肉鸡腹水综合征（ascites syndrome, AS）是缺氧引起的以腹水、肺脏动脉高压和右心衰竭为主要特征的临床综合征。AS肉鸡剖检显示肝脏充血肿大或皱缩，表面凹凸不平，颜色多呈暗红色，常有棕黄色沉积物，肝脏周围有淡黄色或灰白色胶冻状凝块附着，肝静脉和门静脉怒张充血。AS肉鸡心脏功能不全导致肝脏缺乏有效的循环血量和供氧，加重肝损伤最终发生纤维化，引起腹水。缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)作为在缺氧条件下主要的调节因子起着关键作用，缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是HIF-1主要的氧调节亚基，决定其水平及活性。肝纤维化是多种原因引起的反复和慢性肝损伤造成细胞外基质(extracellular matrix，ECM) 积累的病理现象。目前研究认为，肝纤维化的ECM主要由肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)合成， HSC在肝纤维化的发生、发展和逆转过程中起至关重要的作用。当肝脏受到损伤时，HSC表型会发生变化，通过激活α-平滑肌肌动蛋白( α-smooth muscle actin，α-SMA) 转化为肌成纤维细胞（MFB），生成大量ECM。试验通过对AS肉鸡肝组织中α-SMA蛋白的表达量进行测定，进而观察出MFB细胞分布的数量，同时对HIF-1α基因表达含量进行测定，初步探索AS肉鸡肝脏HIF-1α基因的表达与MFB细胞数量的变化关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用鸡采集于新疆阿克苏市郊某肉鸡养殖场，为10周龄健康肉鸡和AS肉鸡。

主要试剂：平滑肌肌动蛋白多克隆抗体兔抗鸡一抗、免疫显色试剂Poly-HRP羊抗小鼠/兔二抗试剂购自武汉三鹰生物技术有限公司，苏木素、伊红、0.01M柠檬酸钠缓冲试剂（pH6.0）购自北京索莱宝科技有限公司，HIF-1α抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，HRP-DAB底物显色试剂盒购自天根生化科技有限公司，（Trans Zol Up Plus RNA Kit）RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、Green qPCR Super Mix 试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。

主要仪器：石蜡包埋机（EG1150）、手动切片机（RM2125）购自Leica 德国，生物显微镜（尼康E200）购自尼康江南光学仪器有限公司，实时荧光定量PCR仪QuantStudio 5购自美国默飞世尔科技公司，梯度PCR仪TC-5000购自法国TECHNE。

1.2 试验方法

1.2.1 样本的采集和保存 取5只10周龄肝脏腹水肉鸡和5只10周龄健康肉鸡的肝脏组织样本，一部分以10%的福尔马林固定；另一半置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 肝脏的显微结构特征观察 10%福尔马林固定的样品，经石蜡包埋，切取5 μm厚度切片放置60 ℃恒温箱烘烤1 h，经二甲苯脱蜡、梯度酒精复水、苏木精-伊红染色后，再经梯度酒精脱水后用中性树胶封片，通过光学显微镜观察肝脏结构的微细结构变化。

1.2.3 利用免疫组化研究肌成纤维细胞的分布 烤片：将已完成的切片在60 ℃条件下烘烤1 h。

脱蜡：将烘干后的切片在二甲苯溶液中脱蜡两次，每次约10 min。

梯度水化：将浸泡后的切片依次置于无水酒精、95%、85%、75%酒精溶液中浸泡，每一次均约5 min，最后将切片置于蒸馏水中漂洗约5 min。

热修复抗原：取枸橼酸盐缓冲液0.01M，将漂洗后的切片浸入，并置于微波炉中加热，沸腾后断电，10 min后再次低火煮15 min，静置待其冷却后用 pH 为7.2～7.6 的PBS冲洗3次，每次约3 min。

阻断：每张切片加50 μL 3%过氧化氢溶液，放置约15 min以使内源性酶失去活性，PBS洗涤3次，每次约5 min。

孵育一抗：向切片上滴加一抗（smooth muscle actin Polyclonal antibody），并置于4 ℃冰箱中，12 h后取出切片，经PBS洗涤3次，每次5 min。

孵育二抗：滴加50～100 μL免疫显色试剂Poly-HRP羊抗小鼠/兔二抗试剂，37 ℃烤箱中放置30 min，PBS液洗涤3次，每次5 min。

DAB显色：滴加预制好的DAB工作液50～100 μL，5 min后镜下观察染色情况并控制反应时间，染色后用蒸馏水洗涤。

苏木素染液浸染5 min，用蒸馏水洗涤后，经PBS返蓝。

梯度溶液(60%～100%)脱水，每级约5 min。取出后将切片置于二甲苯溶液中处理两次，每次约10 min，最后滴加中性树胶封片。通过光学显微镜观察a-SMA蛋白在腹水肉鸡肝脏中不同部位的分布和比例。注：以PBS代为一抗作为阴性对照。

1.2.4 HIF-1α的表达及蛋白含量检测 引物设计：HIF-1α引物参照韩烨晨等的报道，GAPDH通过Primer Premier 5.0软件进行引物设计，由上海生工合成。

肝组织RNA的提取：使用RNA提取试剂盒(TransZol法)进行提取，并用Nanodrop测定RNA浓度。

肝组织RNA的反转录：用Two-Step反转录试剂盒合成cDNA；依次加入Total RNA 1μL、Anchored Oligo(dT)18 Primer（0.5 μg/μL） 1μL、2xES Reaction Mix 10 μL、EasyScript® RT/RI Enzyme Mix 1 μL，gDNA Remover 1 μL、RNasefree Water 6 μL，总体积 20 μL。将20 μL 体系放于PCR仪中反应15 min（42 ℃），85 ℃加热5 s，产物于-20 ℃保存。

实时荧光定量PCR：将反转录产物cDNA浓度稀释10倍，取稀释后cDNA，Green qPCR SuperMix 试剂盒说明书进行操作。依次加入cDNA 1μL、Forward Primer 0.4 μL、Reverse Primer 0.4 μL、2xPerfectStart® Green qPCR SuperMix 10 μL、RNase-free Water 8.2 μL，总体积 20 μL。反应条件为：95 ℃ 30s；95 ℃ 15 s；60 ℃ 30 s；溶解曲线为95 ℃ 15 s；60 ℃1 min；95 ℃ 1 s；40个循环，每个样品做三个生物学重复试验，根据每个样品的Ct 值用2-ΔΔCt 公式计算HIF-1α的mRNA在腹水肉鸡肝脏中的相对表达量。HIF-1α基因引物序列见表1。

表1 HlF-1α 基因引物序列

1.2.5 数据分析 qRT-PCR用GraphPad Prism8.0作图，免疫组化用Image J 1.8.0进行分析。数据用SPSS22.0 软件进行分析，结果以“X±S”表示，以P＞0.05表示差异不显著，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 肝脏的HE染色

结果显示如图1。与健康肉鸡肝组织（图1A）相比，腹水肉鸡肝组织（图1B）完全失去正常结构，肝索排列松散，部分正常肝细胞结构被破坏；肝血窦变大并淤血。出现部分炎性细胞及成纤维细胞。

图1 肉鸡肝脏HE染色(400×)

图1 肉鸡α-SMA染色(400×)

2.2 肝脏α-SMA的表达量

结果显示如图2。与对照组相比，腹水组α-SMA表达更明显。对肝脏组织进行阳性面积测定，结果显示腹水组（图2B）阳性面积比值是（12.70±1.65）%，健康组（图2A）为（0.54±0.36）%，差异显著（P＜0.05）。

2.3 HIF-1α的表达量

结果如图3。qRT-PCR结果显示，HIF-1α在腹水肉鸡肝脏差异表达极显著(P＜0.01)。

图3 HIF-1α在肝脏中的mRNA表达量

3 讨论

研究表明，患有腹水综合征的肉鸡肝脏损伤严重。HIF-1α是在于哺乳动物细胞质内的转录因子，也是引发AS 肉鸡的关键因子，在低氧环境中，HIF-1α在细胞内积聚并与HIF-1β结合形成HIF-1，HIF-1与缺氧反应原件（HRE)结合，参与多条信号转导通路，引起细胞对缺氧的反应。在本试验中，腹水肉鸡肝脏HE染色显示肝组织完全失去正常结构，肝索排列松散，部分正常肝细胞结构被破坏；肝血窦变大并淤血，与健康肉鸡肝脏显微结构差异明显，与李凯的研究结果一致。肉鸡腹水综合征是一种由遗传、营养、环境等多因素导致的营养代谢病，但是缺氧是腹水肉鸡发病的重要因素。前期研究表明，AS肉鸡剖检显示肝脏充血肿大或皱缩，表面凹凸不平，颜色多呈暗红色，常有棕黄色沉积物，肝脏周围有淡黄色或灰白色胶冻状凝块附着，肝静脉和门静脉怒张充血。这是因为AS肉鸡心脏功能不全，继而导致肝脏缺乏有效的循环血量和供氧，加重肝损伤，最终发生纤维化，引起腹水。qRT-PCR结果显示腹水肉鸡的肝脏中HIF-α基因表达极显著(P＜0.01)高于健康肉鸡，说明在低氧环境中，肉鸡体内HIF-1α被激活。肝星状细胞（HSC）在肝纤维化过程中起着重要作用，正常为静息状态，当受到外界因子刺激时，合成分泌平滑肌动蛋白（α-SMA）进而转化为肌成纤维细胞（MFB），因此，MFB水平的变化与肝脏纤维化水平呈正相关。本研究结果显示，腹水肉鸡肝脏α-SMA蛋白含量表达显著（P＜0.05）高于健康肉鸡，与韩烁晨的研究结果一致，这表明在AS发病过程中，MFB参与肝脏的纤维化形成。

4 结论

在AS肉鸡形成的过程中，HIF-α表达均持续升高，肝星状细胞被HIF-1α基因刺激激活，合成分泌α-SMA蛋白，进而成为具有增生性和纤维原性的MFB，导致细胞外基质过度沉积，器官纤维化形成。腹水肉鸡肝脏HIF-α含量及α-SMA含量表达均显著高于健康肉鸡(P ＜0.01, P ＜0.05)，且HIF-1α基因的表达量与MFB细胞的增多成正比。