UPLC 同时测定参芪降糖颗粒中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2和Rd的含量

＊曹 玉

（南京市食品药品监督检验院 江苏 210038）

参芪降糖颗粒由人参（茎叶）皂苷、五味子、黄芪、山药、地黄、覆盆子、麦冬等几味药组成，能够益气养阴、滋脾补肾，主治消渴症、用于Ⅱ型糖尿病，在临床上使用广泛，配合化学药品治疗糖尿病等症状，被广大医生和患者接受[1-3]。经查询，现行该品种质量标准，对有效成分含量测定项，规定了仅检测1个化学成分，为人参皂苷中人参皂苷Re[4]，同时测定其它成分，国内尚未见报道。采用UPLC法同时测定参芪降糖颗粒中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2和Rd的质量，为评价此类该制剂有效成分质量提供了绿色、快速、准确的方法。

1.材料与方法

(1)仪器与试剂

Waters ACQUITY超高效液相色谱仪（UPLC），METTLER TOLED X205DU分析天平。

参芪降糖颗粒（某制药有限公司，批号：00112145），对照品均购自中国食品药品检定研究院：人参皂苷Rg1对照品（批号：110703-202034，含量94.0%），人参皂苷Re对照品（批号：110754-202129，含量96.0%），人参皂苷Rb1对照品（批号：110704-202129，含量94.3%），人参皂苷Rb2对照品（批号：111715-200802，含量94.8%），人参皂苷Rb3对照品（批号：111686-201002，含量92.7%），人参皂苷Rd对照品（批号：111818-201001，含量94.4%）。甲醇采用色谱纯，水为超纯水，其余试剂均分析纯。

(2)对照品溶液的配制

分别精密称定人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1对照品各20mg，人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3和人参皂苷Rd对照品各10mg，称量放置在20mL棕色容量瓶中，加少量甲醇溶解，待完全溶解后，用甲醇稀释至刻度，作为储备液：人参皂苷Rg1、Re和Rb1质量浓度为1mg/mL，人参皂苷Rb2、Rb3和Rd质量浓度0.5mg/mL。

(3)供试品溶液的制备

取参芪降糖颗粒适量混匀，精密称定2.0g，加甲醇50mL，置水浴上加热回流1h，滤过，精取溶液25mL，蒸干，残渣加水10mL使溶解，水液用水饱和的正丁醇提取3次（30mL、30mL、20mL），合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次30mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解，定量转移至10mL量瓶中，并加甲醇稀释至刻度，摇匀，放置即得。

(4)色谱系统条件

采用ACQUITY BEH C18色谱柱BEH Amide3.0x100mm 186004805，乙腈—水为流动相，梯度洗脱（洗脱条件见表1），流速为0.30mL/min，检测波长为203nm，柱温为30℃，进样量1μl。

表1 流动相梯度条件

(5)方法学评价

参芪降糖颗粒处方中共有11味中药，成分复杂，且有4味中药为原粉投料，样品经提取后，杂质干扰较多。本方法考察不同的前处理方式：直接提取法甲醇超声处理进样，正丁醇超声处理；对比回流提取与超声提取，提取时间和温度。最终确定为经甲醇回流提取后，正丁醇振摇提取方式。因该制剂成分较多，故流动相系统采用梯度洗脱方式。同时考察乙腈：磷酸系统、乙腈：水系统、甲醇：磷酸系统、甲醇：水系统，结果证明，乙腈：水梯度洗脱后，各类皂苷色谱峰塔板数、分离度较好。

2.结果

(1)色谱图

该色谱条件下对混合标品和样品的色谱图见图1、图2。

图1 对照品UPLC色谱图

图2 参芪降糖颗粒样品UPLC色谱图

(2)线性范围

取以上对照品储备液，精密量取1.0mL、1.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、3.0mL，置100mL、50mL、25mL、25mL、20mL、10mL量瓶中，加甲醇稀释，定容，摇匀，分别进样1.0μl，以峰面积对对照品浓度绘制曲线，分别得回归方程，结果见表2。

表2 标准曲线

(3)精密度考察

取对照品溶液（人参皂苷Rg1 152.90μg/mL、人参皂苷Re 151.88μg/mL、人参皂苷Rb1 145.97μg/mL、人参皂苷Rb2 73.66μg/mL、人参皂苷Rb 375.92μg/mL、人参皂苷Rd 76.32μg/mL），进样1μl，重复6次，记录峰面积，峰面积RSD%分别为0.17%、0.25%、0.32%、0.14%、0.21%和0.19%，表明精密度良好。

(4)重复性考察

制备6份平行供试品溶液，分别进样1.0μL，记录色谱峰面积，以计算平均含量，分别为人参皂苷Rg 10.48mg/g、人参皂苷Re 1.27mg/g、人参皂苷Rb1 0.40mg/g、人参皂苷Rb2 0.95mg/g、人参皂苷Rd 1.23mg/g，RSD%分别为0.28%、0.47%、0.44%、0.25%和0.31%，表明重复性良好。

(5)稳定性考察

随机取已制备样品溶液1份，分别于0h，3h，6h，12h，24h时各进样1.0μL，记录主峰面积。人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd峰面积的相对标准偏差分别为0.20%、0.11%、0.37%、0.20%和0.19%，试验表明该方法稳定性良好。

(6)准确度考察

精密称取9份已测定有效成分含量的样品颗粒，每份混匀后精密称定1.0g，分别加入规定量的5种混合对照品溶液（用甲醇补足剩余体积），照2.2项下“供试品溶液的制备方法”制备，依法测定，计算加样回收率，结果见表3、表4、表5、表6和表7。结果表明，准确度良好。

表3 人参皂苷Rg1准确度测定数据

表4 人参皂苷Re准确度测定数据

表5 人参皂苷Rb1准确度测定数据

表6 人参皂苷Rb2准确度测定数据

表7 人参皂苷Rd准确度测定数据

(7)依方法检验供试品含量测定数据

精密称取以上样品6份，依照2.2项下“供试品溶液的制备方法”，依法测定，测定含量。平均含量分别为人参皂苷Rg 10.48mg/g、人参皂苷Re 1.27mg/g、人参皂苷Rb1 0.40mg/g、人参皂苷Rb2 0.95mg/g、人参皂苷Rd 1.23mg/g，RSD%分别为0.27%、0.36%、0.51%、0.21%和0.29%。

3.讨论

五加科植物人参中，各类人参皂苷成分比较复杂，种类繁多，每个化学成分都对应某一特定结构，若仅针对单一成分或检测其中的少数，成分难以反映制剂的整体质量。采用普通高效液色谱法HPLC，检测分析人参皂苷类各类成分，耗时较长，且浪费大量有机试剂，对前处理时间，仪器稳定性，实验室环境等均有一定要求。以《中国药典》2020年版[5]复方丹参片为例，测定五加科植物三七中的3个成分（Rg1、Re、Rb1），分析一针就需要110min，并且其中人参皂苷Rg1和Re的分离度效果不理想，需要调整色谱条件，经常更换合适的色谱柱，多次试验后，造成已配置溶液稳定性下降，仪器状态无法保证，浪费大量有机试剂，造成实验室污染。鉴于以上含五加科植物的中药复方制剂成分有一定复杂性，其目前的法定检验方法存在可调整的空间，有必要对其主要皂苷类成分进行多组分含量的控制。UPLC法因分析时间短、分离效率高、流动相用量小、对环境污染小，越来越多地应用于中药复方制剂中复杂组分的含量测定[6-10]。

采用本文的供试品制备方法，人参皂苷Rb3成分没有和杂质有效分离，由于时间有限，没有更进一步研究。如增加样品后续的除杂步骤和次数，增加氨试液或者采用柱层析的处理方式，将在未来中进一步研究，完善供试品的处理方法。