免疫荧光双重染色在结核分枝杆菌肺炎患者中的诊断应用

王仁德

肺结核（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌所引起的一种慢性传染病，目前仍是威胁全球公共卫生健康的重大传染病[1]。当前由于各种因素的影响，结核分枝杆菌肺炎的发病例数依然较多，可严重影响患者的身心健康[2]。当前随着现代结核病控制策略的广泛实施，结核分枝杆菌肺炎的死亡率有了明显下降，但是治疗周期仍然维持在12 个月左右，导致患者依从性差，治愈率不尽人意，为此加强早期诊断具有重要价值[3]。当前对于结核分枝杆菌肺炎的诊断方法主要为体外分离培养和涂片镜检，虽然准确率比较高，但是存在培养周期长、敏感性低等不足[4]。结核分枝杆菌肺炎的免疫诊断具有简单、快速、敏感性高、特异性高等优势，主要依靠结核分枝杆菌肺炎侵入宿主的体液和细胞免疫应答而设计，但是很难鉴别结核分枝杆菌感染与环境中非结核分枝杆菌和接种卡介苗后的致敏状况[5-6]。随着医学技术的发展，免疫荧光双重染色得到了广泛应用，其可根据待测物的特性以及检测的具体条件，筛选出最合适的检测方法，通过测定复合物上标记物的荧光强度，即可确定样品中待测抗原含量，从而进行临床诊断[7]。本文具体探讨与分析了免疫荧光双重染色在结核分枝杆菌肺炎患者中的诊断应用，以促进免疫荧光双重染色的临床应用。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2019 年3 月-2021 年3 月在佳木斯市肿瘤医院诊治的结核分枝杆菌肺炎患者66 例作为结核组，同期选择非结核分枝杆菌肺炎患者66 例作为非结核组。纳入标准：两组患者均符合肺炎的诊断标准[8]；结核组直接痰涂片镜检2 次痰菌阳性，胸片显示有活动性肺结核病变阴影；病程≥3 年；年龄20～80 岁；小学及以上文化水平。排除标准：妊娠与哺乳期妇女；合并有肿瘤的患者；合并有其他传染性疾病的患者；诊治期间死亡的患者；临床资料缺乏的患者；不配合调查的患者；合并有精神疾病患者；标本污染或怀疑污染者。患者均签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 采集所有患者的胸腔积液标本，患者完成盐酸利多卡因局部麻醉后，超声引导下胸腔穿刺引流进行采集标本（≥5 mL），把采集的标本分为三份，保存于-20 ℃冰箱。

1.2.2 检测方法

1.2.2.1 涂片镜检-荧光染色法检测 取所有患者第一份样本，涡旋振荡混匀后吸取5 mL 到无菌离心管中，按照体积比1︰1 加入浓度为4.0%的氢氧化钠溶液。液化样本后，室温静置15 min，3 000 r/min 离心10 min。取沉淀涂抹于玻片正面，干燥后进行荧光染色镜检。荧光染色镜检过程包括初染-脱色-复染，然后进行荧光显微镜镜下观察，在×40 物镜下观察结核分枝杆菌的形态并计数。

1.2.2.2 免疫荧光双重染色法检测 取第二份样本行免疫荧光双重染色法染色，荧光标记物为以FITC标记的羊抗兔IgG 兔抗结核分枝杆菌多克隆抗体PPD 和以Cy5 标记的羊抗鼠IgG 鼠抗ESA-T-6 单克隆抗体。免疫荧光双重染色后采用激光扫描共聚焦显微镜进行观察，双重荧光标记选用波长为405 nm和635 nm，采用双通道同时接收信号成像。所有检测结果都由检验科资深医师（工作年限≥10 年，职称为副高及其以上）进行判定。同时取所有患者的第三份样本进行胸腔积液生化指标检测，检测指标包括胸腔积液腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、总蛋白（total protein，TP）、葡萄糖（glutamate，GLU）等。

1.3 统计学处理 采用SPSS 24.0 软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 两组肺炎病程、受教育年限、体重指数、性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性，见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 两组胸腔积液标本生化指标比较 结核组的ADA、LDH、TP、GLU 水平均高于非结核组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 两组胸腔积液标本生化指标比较（±s）

表2 两组胸腔积液标本生化指标比较（±s）

2.3 不同方法结核分枝杆菌检出率比较 在66 例结核分枝杆菌肺炎患者中，涂片镜检-荧光染色法检出57 例，检出率为86.4%（57/66）；免疫荧光双重染色法检出65 例，检出率为98.5%（65/66），不同方法结核分枝杆菌检出率比较，差异有统计学意义（χ2=8.033，P=0.005）。

2.4 诊断敏感度与特异度 在两组132 例患者中，涂片镜检-荧光染色法的诊断敏感度与特异度分别为84.8%和98.5%，免疫荧光双重染色法的诊断敏感度与特异度分别为98.5%和100%，见表3。ROC 分析显示涂片镜检-荧光染色法与免疫荧光双重染色法的曲线下面积分别为0.822 和0.984。见图1、2。

表3 不同方法在结核分枝杆菌肺炎患者诊断中的敏感度与特异度（例）

图1 涂片镜检-荧光染色法诊断结核分枝杆菌肺炎的ROC曲线

3 讨论

图2 免疫荧光双重染色法诊断结核分枝杆菌肺炎的ROC曲线

结核分枝杆菌肺炎是一种由空气传播的慢性传染性疾病，当前由于流动人口增多以及耐药结核病的发展，使得结核分枝杆菌肺炎重新成为人们比较关注的公共卫生问题[9]。结核分枝杆菌肺炎与非结核分枝杆菌肺炎在临床特征上比较类似，症状具有复杂性和特殊性，对于鉴别诊断的要求比较高[10]。涂片镜检-荧光染色法为结核分枝杆菌的常规检测方法，特别是结核分枝杆菌对荧光染料有亲和性，从而可以被染上荧光[11]。而进行荧光染色镜检具有敏感性高、无汞蒸气污染、操作成本低、操作过程简单、荧光性强等特点，但是诊断的敏感度有待提高[12]。

胸腔积液生化指标检测的敏感性更低，存在很多局限性，易出现误诊进而影响患者治疗[13]。现代研究表明结核分枝杆菌为一种胞内寄生菌，侵入机体后可被单核巨噬细胞吞噬，且机体受到结核分枝杆菌感染后，在机体内可出现结核分枝杆菌特异性抗原，为此进行结核抗原的检测具有一定的临床价值[14]。本研究显示结核组的胸腔积液标本ADA、LDH、TP 与GLU 水平均高于非结核组（P<0.05）；在66 例结核分枝杆菌肺炎患者中，涂片镜检-荧光染色法检出57 例，检出率为86.4%；免疫荧光双重染色法检出65 例，检出率为98.5%，差异有统计学意义（P<0.05），表明免疫荧光双重染色在结核分枝杆菌肺炎患者中的应用具有更高的检出率。从机制上分析，结核分枝杆菌的细胞学免疫检测也具有快速、高效等特征，其中结核菌素纯化蛋白衍生物（purified protein derivative，PPD）是一种包含有多种不同变性阶段蛋白质的混合物，已长期运用于结核分枝杆菌的检测[15-16]。但是其单独使用的特异性比较差，其许多成分与卡介苗和非结核分枝杆菌的抗原成分相同。早期分泌性抗原靶6（early secretory antigen target-6，ESAT-6）由RD1 区编码，为结核分枝杆菌感染早期所分泌的蛋白，只存在于结核菌群中，为此其检测能有效的区分结核菌感染和卡介苗接种情况，涂片镜检-荧光染色法与免疫荧光双重染色法的联合使用可提高对于结合分枝杆菌肺炎的临床检出率[17]。

结核分枝杆菌肺炎的控制是一个系统的过程，及时有效的诊断具有重要价值。免疫荧光双重染色分析可利用累加多次激发后的荧光信号，荧光衰变时间长，可提升检测准确度与特异度[18]。ESAT-6可通过诱导含NLR 家族PYRIN 域蛋白3（NLRP3）炎症小体的活化，从而引起巨噬细胞的坏死和炎症反应。PPD 可反应机体的中性粒细胞变化情况，也可介导分枝杆菌抗原引起的CD4+T 细胞介导迟发型超敏反应[19]。本研究显示在两组132 例患者中，涂片镜检-荧光染色法的诊断敏感度与特异度分别为84.8%和98.5%，免疫荧光双重染色法的诊断敏感度与特异度分别为98.5%和100%；ROC 分析显示涂片镜检-荧光染色法与免疫荧光双重染色法的曲线下面积分别为0.822 和0.984，表明免疫荧光双重染色在结核分枝杆菌肺炎患者中的诊断应用具有很高的敏感度与特异度。从机制上分析，免疫荧光双重染色可以避免结核病患者由于免疫应答低下导致的免疫检测假阴性。同时激光扫描共聚焦显微镜具有高分辨率高、敏感度高等特点，还可通过累加多次激发后的荧光信号，同时检测多种物质提高检测效率，检测过程不受蛋白类物质稳定性和空间结构的影响，从而具有很高的诊断价值[20-21]。本研究由于经费与人力限制，没有进行大样本量分析，也没有设置正常对照组，将在后续研究中探讨。

综上所述，免疫荧光双重染色在结核分枝杆菌肺炎患者中的应用诊断敏感度与特异度都在98.0%以上，可提高检出率，可为结核分枝杆菌肺炎的早期诊断提供一定的依据。