FOXP3、MUC5AC在支气管炎患儿中的表达及与Th9细胞因子的相关性研究

段巧玲,张洪岩,赵 悦,孙亚娟,李 莹,成佳文,周兴棉△,崔功颢,曹晨玮

河北中医学院第二附属医院：1.儿科；2.检验科，河北定州 073000

支气管炎是婴幼儿常见的下呼吸道感染性疾病，最常见病因为病毒感染，主要为呼吸道合胞病毒(RSV)，是世界范围内婴幼儿住院的最常见原因，也是儿童发生哮喘的主要独立危险因素[1]。免疫功能失调是小儿支气管炎发病的重要机制[2]。近年来研究发现，辅助性T细胞9(Th9)细胞作为一种新型Th细胞亚群，其主要免疫学机制是活化炎症细胞，分泌趋化及炎性因子，导致炎性损伤[3]。已有研究报道，支气管炎患儿急性期外周血中Th9细胞因子表达明显升高[4]。叉状头/翼状螺旋转录因子(FOXP3)是叉状头/翼状螺旋转录调节因子家族成员，可作为CD25+T细胞的特异性标志，与机体免疫调节功能密切相关[5]。气道黏液高分泌是小儿支气管炎的病理生理特征，而黏蛋白是维持黏液黏弹性的主要成分[6]。黏蛋白5AC(MUC5AC)是气道黏液中最为重要的黏蛋白，常作为衡量气道上皮黏液分泌的指标[7]。目前，关于FOXP3、MUC5AC在支气管炎患儿中表达的研究较少，且FOXP3、MUC5AC表达与Th9细胞因子关系及是否与哮喘发生有关联，也少见报道。基于此，本研究对此展开探讨，旨在为小儿支气管炎发病机制完善、临床治疗及哮喘早期防治提供依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年2月至2021年2月本院收治的支气管炎患儿94例作为观察组，选取同期健康体检儿童45例作为对照组。观察组男56例，女38例；月龄2～19个月，平均(7.26±2.24)月；病程1～5 d,平均(2.71±0.75)d；体质：特应性体质41例，非特应性体质53例；病情严重程度：轻度30例，中度41例，重度23例；呼吸疾病史：有73例，无21例；食物过敏史：有12例，无82例；居住环境：城镇52例，农村42例；父亲吸烟54例；分娩方式：自然分娩59例，剖宫产35例；出生时母亲年龄21～34岁，平均(27.16±2.61)岁。纳入标准：观察组均符合《诸福棠实用儿科学》[8]中支气管炎诊断标准，入院前未接受任何免疫抑制剂或免疫增强剂治疗；家属均知情，并签署承诺书。排除标准：呼吸道先天畸形；先天性心脏病、免疫缺陷病；合并哮喘等其他呼吸系统疾病；合并慢性消耗性疾病。对照组男26例，女19例；月龄2～21个月，平均(7.51±2.19)月；呼吸疾病史：有35例，无10例；食物过敏史：有6例，无39例；居住环境：城镇24例，农村21例；父亲吸烟26例；分娩方式：自然分娩28例，剖宫产17例；出生时母亲年龄22～32岁，平均(26.98±2.33)岁。两组年龄、性别、呼吸疾病史、食物过敏史、居住环境、父亲吸烟情况、分娩方式、出生时母亲年龄基础资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法 (1)FOXP3 mRNA检测。采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定，治疗前取外周静脉血3 mL，采用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞(PBMC)，以Trizol提取总RNA，反转录合成cDNA，后进行PCR扩增，以β-actin为内参，FOXP3引物：上游(5′-3′)为CTG ACC AAG GCT TCA TCT GTG，下游(5′-3′)为ACT CTG GGA ATG TGC TGT ITC；β-actin：上游(5′-3′)为TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG，下游(5′-3′)为CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，分析各条带平均灰度值，结果以FOXP3/β-actin的Ct比值表示。(2)MUC5AC mRNA检测。采用RT-PCR测定，治疗前，晨起空腹2 h，3%高渗盐水10 mL氧泵吸入10～15 min，雾化后拍背1～2 min，吸痰3～5 mL，以Trizol提取总RNA，反转录合成cDNA，后进行PCR扩增，以β-actin为内参，MUC5AC引物：上游(5′-3′)为TGC CAG GAG CTG CGG ACC TC，下游(5′-3′)为CCG AGC TCA GAG GAC ATA TGG G；β-actin：上游(5′-3′)为TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG，下游(5′-3′)为CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，分析各条带平均灰度值，结果以MUC5AC/β-actin的Ct比值表示。(3)Th9细胞、白细胞介素-9(IL-9)：采用流式细胞学检测PBMC中Th9细胞比例；另取外周静脉血3 mL，3 500 r/min，半径8 cm，离心9 min，取血清，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-9，采用北京朗顿公司试剂盒。

1.3观察指标 (1)观察组与对照组FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA、IL-9水平及Th9细胞比例。(2)不同病情支气管炎患儿FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA、IL-9水平及Th9细胞比例。根据Bearman和Pierson[9]修订的临床评分标准，评分4～6分、7～9分、10～12分，分别为轻度、中度、重度。(3)支气管炎患儿FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA、IL-9及Th9细胞比例与病情严重程度的相关性。(4)支气管炎患儿FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA与Th9细胞比例的相关性。(5)患儿治疗后随访6个月，观察患儿预后(是否有喘息发作)情况。支气管炎患儿预后的影响因素。

2 结 果

2.1观察组与对照组FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA、IL-9水平及Th9细胞比例比较 观察组FOXP3 mRNA、IL-9水平低于对照组，MUC5AC mRNA、IL-9水平及Th9细胞比例高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 观察组与对照组FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA、IL-9水平及Th9细胞比例比较

2.2不同病情严重程度支气管炎患儿FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA、IL-9水平及Th9细胞比例比较 不同病情支气管炎患儿FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA、IL-9水平及Th9细胞比例比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；随病情严重程度加重，FOXP3 mRNA逐渐降低，MUC5AC mRNA、IL-9水平及Th9细胞比例逐渐升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 不同病情严重程度支气管炎患儿FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA、IL-9水平及Th9细胞比例比较

2.3支气管炎患儿FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA、Th9细胞比例及IL-9与病情严重程度的相关性 Spearman相关性分析可知，支气管炎患儿FOXP3 mRNA与病情严重程度呈负相关(r=-0.657，95%CI：-0.762～-0.520，P<0.001)，MUC5AC mRNA(r=0.842，95%CI：0.797～0.907，P<0.001)、Th9细胞比例(r=0.691，95%CI：0.564～0.786，P<0.001)、IL-9(r=0.750，95%CI：0.642～0.829，P<0.001)与病情严重程度均呈正相关。见图1～4。

图1 FOXP3 mRNA与病情严重程度相关性

图2 MUC5AC mRNA与病情严重程度相关性

图3 Th9细胞比例与病情严重程度相关性

图4 IL-9与病情严重程度相关性

2.4支气管炎患儿FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA与Th9细胞比例及IL-9的相关性 Pearson相关性分析可知，支气管炎患儿FOXP3 mRNA与Th9细胞比例(r=-0.834，95%CI：-0.855～-0.801，P<0.001)、IL-9(r=-0.831，95%CI：-0.854～-0.798，P<0.001)均呈负相关；MUC5AC mRNA与Th9细胞比例(r=0.837，95%CI：0.807～0.858，P<0.001)、IL-9(r=0.872，95%CI：0.858～0.881，P<0.001)均呈正相关。见图5～8。

图5 FOXP3 mRNA与Th9细胞比例相关性

图6 FOXP3 mRNA与IL-9相关性

图7 MUC5AC mRNA与Th9细胞比例相关性

图8 MUC5AC mRNA与IL-9相关性

2.5支气管炎患儿预后影响因素的单因素分析 94例支气管炎患儿治疗后随访6个月，21例发生喘息，发生率为22.34%(21/94)。体质、病情分度、FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA、Th9细胞比例、IL-9均为支气管炎患儿喘息发作的影响因素(P<0.05)，见表3。

2.6支气管炎患儿预后影响因素的多因素分析 以支气管炎患儿治疗后6个月喘息发作情况为因变量(无喘息发作=0，喘息发作=1)，将表3中差异有统计学意义的因素作为自变量(体质：特应性体质=1，非特应性体质=2；病情程度：轻度=1，中度=2，重度=3；FOXP3 mRNA：低表达=1，高表达=2；FOXP3 mRNA：低表达=1，高表达=2；Th9细胞比例：低表达=1，高表达=2；IL-9：低表达=1，高表达=2)，应用Logistic回归模型分析，结果显示，将体质、病情程度控制后，FOXP3 mRNA低表达，FOXP3 mRNA、IL-9高表达及Th9细胞比例升高为喘息发作的独立危险因素(P<0.05)，见表4。

表3 支气管炎患儿预后影响因素的单因素分析[n(%)]

表4 支气管炎患儿预后影响因素的多因素分析

3 讨 论

小儿支气管炎特点是炎性因子和黏液分泌增加，导致呼吸急促、鼻炎、呼吸做功增加等一系列呼吸道症状，且与患儿后期复发性喘息和哮喘发病存在密切关系[10]。研究证实，Th细胞通过识别病毒抗原并触发细胞、体液免疫，在小儿支气管炎发病中发挥关键作用[11]。Th9细胞是近年来发现的一类CD4+T细胞亚群，其主要通过分泌IL-9参与自身免疫性疾病、支气管哮喘等病理过程[12]。目前，Th9细胞及IL-9在小儿支气管炎发病机制中的作用尚少见报道，本研究显示，相较于健康体检儿童，支气管炎患儿Th9细胞比例、IL-9水平升高，且与病情严重程度呈正相关。Th9细胞由转化生长因子和IL-4联合刺激下分化而来，以大量分泌IL-9为特征，IL-9可促进T淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞增殖，增加IL-17、IL-8、转化生长因子-β、组胺、血管内皮生长因子等因子释放，促进气道重塑，参与机体炎症反应[13]。因此，Th9细胞可能通过上述机制参与了小儿支气管炎的发生发展。

CD4+CD25+Treg是主要表达CD25分子的CD4+T细胞亚群，可强烈抑制Th2产生及Th2所诱导的嗜酸粒性细胞在气道聚集，研究证实，支气管炎患儿CD4+CD25+Treg表达下调[14]。FOXP3是CD4+CD25+调节性T细胞分化发育的关键基因[15]。研究显示，FOXP3突变小鼠存在多器官炎症应答反应，出现嗜酸性粒细胞增高、过敏性气道炎症、Thl/Th2型细胞因子失衡[16]。本研究通过RT-PCR检测发现，支气管炎患儿FOXP3 mRNA表达水平明显低于健康体检儿童，且与病情严重程度呈显著负相关，同时，其表达水平与Th9细胞比例、IL-9存在依赖关系。说明支气管炎患儿体内FOXP3 mRNA水平降低，可能引起Th9细胞比例、IL-9升高，造成免疫调节功能受损。FOXP3 mRNA低表达可引起外周血CD4+CD25+Treg细胞数量不足，免疫抑制功能降低，进而引起效应性CD4+T细胞尤其是Th2细胞大量增殖活化，Th9细胞比例及IL-9升高，产生大量致炎因子，促进支气管炎患儿病情进展[17]。

黏蛋白是呼吸道黏液的主要成分，而MUC5AC作为气道黏液中最为重要的黏蛋白，在肺部疾病中受到了广泛关注[18]。MUC5AC产生调控有3条重要信号通路，叉头转录因子A2(FoxA2)是MUC5AC表达抑制剂；IL-13诱发黏液化生和MUC5AC表达；表皮生长因子受体诱导MUC5AC表达[19]。支气管炎患儿IL-13异常高表达，上调信号转导与转录活化因子6磷酸化，并抑制FoxA2，进而促进MUC5AC表达，导致黏液高分泌。因此，MUC5AC参与小儿支气管炎发生及病情发展。进一步分析发现，支气管炎患儿MUC5AC mRNA与Th9细胞比例、IL-9呈正相关。研究表明，IL-9可能通过钙激活氯离子通道调控黏蛋白表达，促进呼吸道上皮细胞分泌黏液，促使炎症细胞在气管、支气管及肺部聚集，加重局部炎症反应[20]。因此，推测MUC5AC与Th9细胞因子协同参与小儿支气管炎病情进展。

婴幼儿时期反复呼吸道感染，尤其是支气管炎对婴幼儿哮喘发病有很大影响。研究显示，50%以上毛细支气管炎患儿在2～3岁有复发性喘息，随时间推移，喘息症状趋于好转，但仍有15%～30%在学龄前期发生哮喘[21]。目前，临床尚缺乏有效的客观指标预测小儿支气管炎的转归。本研究采用Logistic回归模型分析显示，将体质、病情程度控制后，FOXP3 mRNA低表达，FOXP3 mRNA、IL-9高表达、Th9细胞比例为喘息发作的独立危险因素。RSV支气管炎患儿易转变为儿童哮喘，Th2源性细胞因子在其中发挥主要作用已得到公认[22]。IL-9是Th2细胞源性细胞因子，通过诱导嗜酸性粒细胞聚集、黏膜分泌黏液增加等参与过敏性慢性气道炎症反应，在哮喘发病过程中发挥重要作用[23]。支气管炎患儿存在表达FOXP3 mRNA的调节性T细胞减少，该群调节性T细胞异常可能是支气管炎演变为哮喘的重要原因之一[24]。气道黏液高分泌是哮喘的一个特征性病理生理改变，MUC5AC在哮喘中的作用已得到公认[25]。另外，FOXP3 mRNA、FOXP3 mRNA表达水平与Th9细胞比例、IL-9水平存在明显相关性，可能协同参与喘息发作，但相关生物途径需进一步研究加以证实。因此，早期测定FOXP3 mRNA、FOXP3 mRNA、IL-9水平及Th9细胞比例，预测喘息发作风险，可为哮喘早期防治提供依据。

支气管炎患儿FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA与Th9细胞因子存在明显相关性，各指标异常表达可能是免疫功能失调的机制之一，并增加治疗后喘息发作风险。但FOXP3 mRNA、MUC5AC mRNA影响Th9细胞因子的具体通路仍有待进一步探讨。