铁还原菌联合芬顿氧化降解苯酚的机理研究

高卫国

（上海宝发环科技术有限公司，上海 200000）

苯酚是酚醛树脂、农药及药物的重要原料，环境中苯酚会导致鱼类和农作物无法食用，严重的甚至会影响水体中鱼类的繁殖，影响生态平衡[1-2]。含酚废水的化学处理方法包括化学沉淀法、化学氧化法和混凝法等，但这些方法均不适用于低浓度苯酚的去除；经过萃取和吸附处理的含酚废水依然难以达标排放，仍需进一步处理，并且萃取法采用的有机物可能残余至出水中。

生物法降解苯酚对环境友好，可以显著减少环境二次污染[3-4]。环境中普遍存在异化铁还原，这一类微生物以高价金属为电子受体，通过耦合氧化小分子有机物，从而获得自身生长所需能量[5-6]。在厌氧条件下，异化铁还原菌能通过代谢活动将三价铁（Fe(III)）还原为二价铁（Fe(II)）[6-7]，但由于受限于微生物生长条件，生物降解苯酚无法得到广泛的应用[3，8]。

芬顿氧化技术是典型的高级氧化技术，芬顿试剂对苯酚降解彻底，但需要投加大量催化剂，成本较高[9]。Shewanella sp. 能将Fe (Ⅲ) 还原为Fe (Ⅱ)，若能将Shewanella sp. 的异化铁还原过程与芬顿氧化技术进行联合，对芬顿氧化后的催化剂进行还原，实现催化剂的循环利用，便能降低芬顿氧化技术的使用成本，也能对芬顿氧化过程的铁泥进行处理[10]。因此，本研究利用Shewanella oneidensis MR-1 利用乳酸钠或苯酚为电子供体，对水铁矿、赤铁矿和柠檬酸铁三种铁氧化物进行还原，旨在探究Shewanella oneidensis MR-1直接对苯酚的降解效果及其与芬顿反应联合，间接参与降解苯酚的可行性，为含苯酚废水和地下水的处理提供一种绿色可靠的治理技术。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌株Shewanella oneidensis MR-1（MR-1）来自中国海洋微生物菌种保藏管理中心。将菌种于30 ℃的LB 培养基中培养20 h 达到指数生长期，离心收集细胞（5 000 rpm,10 min），然后用无菌水清洗3 次。将细胞重悬于无机盐培养基中，获得指数生长期的菌液（OD600=1.0），用于后续实验。水铁矿的制备方法参考文献[11]。

1.2 铁还原菌对苯酚耐受性

分别配置苯酚浓度为0 mg/L，20 mg/L ，40 mg/L，80 mg/L 的无机盐培养基，调pH 值为7.0，每个处理组设3 组平行。分别加入MR-1 菌悬液1 mL（OD600为1.0），分别在0 h，2 h，5 h，8 h，10 h，23 h，33 h，48 h 测定细菌生长情况（OD600）。

1.3 异化铁还原- 芬顿氧化联合降解苯酚

MR-1 生物降解苯酚：用初始浓度分别为10 mmol/L 和40 mmol/L 的苯酚替代原实验中的乳酸钠作为唯一电子供体，水铁矿为电子受体进行铁氧化物还原实验。设不加菌液的无菌对照和加入2 mL 细菌使用液后120 ℃灭菌20 min 的灭菌对照。

芬顿氧化降解苯酚：配置3 g/L 苯酚溶液和3%H2O2溶液。用1 mol/L 盐酸调节pH 至3.0，加入1.25 mg/L 的FeSO4·7H2O 和0.5 mL 的3% H2O2溶液进行芬顿反应。

MR-1- 芬顿氧化联合降解苯酚：收集经细菌还原后的水铁矿离心（M- 水铁矿，12 000 rpm，2 min），无菌去离子水重复清洗3 次，并用无菌水重悬备用。配置与芬顿氧化一致的反应体系，加入等体积M- 水铁矿，加入0.5 mL 的3% H2O2溶液进行芬顿反应。

1.4 水铁矿在异化铁还原- 芬顿氧化联合中的循环利用

以M- 水铁矿为唯一电子受体，按上述反应体系研究水铁矿的还原在芬顿氧化体系中的循环过程。培养过程中取样测定其中Fe(Ⅱ)和总铁浓度。

1.5 分析方法

利用邻菲啰啉分光光度法测定溶液中的Fe(II)浓度。采用高效液相色谱对苯酚浓度进行检测。

2 结果和分析

2.1 铁还原菌对苯酚降解

MR-1 在不同苯酚浓度下生长情况不同，见图1。MR-1 在无苯酚添加处理中48 h 内增长较快（OD600=1.20），10 h 后细菌的生长速率迅速增加，进入对数生长期，33 h 后趋于稳定。随着苯酚浓度的增加，MR-1 的生长量减少，但影响程度不同。苯酚浓度20 mg/L 时对细菌的生长基本无影响，细菌48 h 的增长量与对照组没有显著差异；苯酚浓度40 mg/L 时，细菌48 h 增长量为0 mg/L 时的69.1%；苯酚浓度80 mg/L 时，细菌48 h 增长量为0 mg/L 时的62.70%。

图1 苯酚浓度对Shewanella oneidensis MR-1 生长的影响

在MR-1 降解苯酚的实验中，分别以10 mg/L 和40 mg/L 苯酚代替乳酸钠为电子供体，初始Fe(Ⅲ)浓度为46.7 mmol/L，结果发现添加MR-1 的处理组上清液无色但浑浊，底部橙色水铁矿无明显颜色变化与无菌对照组和灭菌对照组一致。培养25 d 后MR-1对10 mg/L 和40 mg/L 的苯酚均无明显的降解效果，苯酚浓度与对照组无明显差异，说明MR-1 对苯酚没有降解作用。

图2 Shewanella oneidensis MR-1 对苯酚的降解

2.2 MR-1- 芬顿氧化联合降解苯酚

将MR-1 还原的水铁矿（M- 水铁矿）与培养基分离，清洗去除表面吸附的培养基，在初始pH 为3 条件下进行非均相芬顿氧化降解苯酚，同时与FeSO4参与的传统芬顿氧化进行比较（Fe2+），不加铁源的对照组（H2O2）反映了H2O2自身氧化性对苯酚的氧化，不加H2O2的对照组（水铁矿）反映水铁矿对苯酚的吸附作用。加入H2O2后，加入Fe2+的处理组溶液迅速由浅绿色变黄，之后在反应的60 min 内逐渐产生黄色固体，混合液逐渐变浑浊；其他处理组和对照组在反应60 min 过程中颜色均无明显变化。苯酚的降解曲线见图3。

图3 芬顿法对苯酚的氧化降解

在M- 水铁矿芬顿反应体系中，在投加H2O2后即苯酚发生降解，降解率为82.4%，并在之后60 min 处于稳定；在Fe2+的芬顿反应体系中，添加与初始水铁矿Fe 浓度相同的Fe2+离子，苯酚在投加H2O2后降解率为34.7%。褚衍洋等[12]利用FeSO4进行传统芬顿氧化降解苯酚的实验中，苯酚和COD 浓度均在1 min内迅速降解，与本实验的结果类似。而且，经MR-1 还原的M- 水铁矿能获得比传统芬顿反应更好的降解效果。

图4 为不同处理组和对照组的苯酚降解率比较，采用MR-1 还原的M- 水铁矿与芬顿氧化联合对苯酚的降解率能达到82.4%，显著高于Fe2+为铁源的传统芬顿氧化（34.7%）。H2O2自身氧化性对苯酚的氧化作用和水铁矿的吸附作用很小，因此，M- 水铁矿能作为铁源参与芬顿氧化，催化分解H2O2生成羟基自由基，高效降解苯酚。

图4 芬顿氧化苯酚降解率

2.3 水铁矿在异化铁还原- 芬顿氧化联合中的可循环性

将芬顿氧化后的M- 水铁矿离心，洗净，再次用MR-1 进行还原实验。结果发现Fe(Ⅱ)浓度在0～3 d由0.243 mg/L 逐渐增至0.952 mg/L，在3 d 之后基本稳定，而Fe(Ⅲ)浓度在0～3 d 由2.844 mg/L 逐渐降至2.048 mg/L。

从细菌生长曲线的角度看，MR-1 对氧化后的M-水铁矿在1 d 时已开始进行异化铁还原过程，且Fe(Ⅱ) 的生成主要发生在第1 天和第3 天，0～1 d 和2～3 d Fe(Ⅱ)浓度的增长量分别占总增长量的40.0%和54.1%。

MR-1 对氧化后的M- 水铁矿的铁还原率约为21.4%，未经芬顿氧化的水铁矿在实验4 d 后铁还原率能达到64.9%，第二次还原的水铁矿铁还原率约为第一次还原水铁矿的33.05%。具体原因如下。

（1）相的差异。最初使用的水铁矿为不定型铁氧化物，与铁氧化过程中第一阶段的水解沉淀过程类似，形成了低结晶度的水铁矿[16]；芬顿氧化过程之后收集的M- 水铁矿为固相中氧化形成的铁氧化物。

（2）转化过程的差异。铁氧化物的转化与多种因素有关，如温度、pH 值、不同的外加物质等，其中pH值是决定性的因素[16]。异化铁还原过程是微生物通过电子的传递降低结晶度，形成热力学更稳定的形式[16]，在本实验中的异化铁还原过程发生在pH 值为7.0 左右的条件下，定义还原后的铁氧化物为M- 水铁矿；而芬顿氧化过程中的M- 水铁矿，是在pH 值为3.0 左右环境下形成的铁氧化物。也有研究表明，微生物的胞外多聚物也能影响铁氧化物的结晶形式[13]。

因此，经MR-1 的异化铁还原过程的M- 水铁矿和芬顿氧化过程产生的铁氧化物的结构和结晶度发生改变，并且用于循环的铁氧化物结晶度高于初始的水铁矿，从而导致MR-1 对氧化后M- 水铁矿的利用率降低。

本研究利用异化铁还原菌Shewanella oneidensis MR-1 将芬顿氧化与微生物介导的铁还原过程结合，构成异化铁还原- 芬顿氧化联合反应进行初步探索，为芬顿污染水体治理提供了一种绿色环保的治理技术，也拓宽了芬顿反应在环境中应用界面。今后有待于进一步研究循环过程中提高铁的还原作用，及其对其他环境污染物的去除机理。