实时荧光定量PC R 方法在蜂学研究中的应用

王艺桦，王红坤，周云倩，董 坤，周丹银，张 炫

（云南农业大学动物科学技术学院蜂学系，云南 昆明 650201）

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，RT-qPCR）是一种在DNA 扩增反应中利用化学荧光物质的积累，实时、准确、快速地测定每次聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）后产物总量的方法。测定过程中，通过选定参照物作为标准品，对待测样品中的特定DNA 序列进行定量分析。1985 年，美国PE-Cetus 公司人类遗传研究室的Mullis 等研发了体外核酸扩增技术，即PCR 技术[1]。传统PCR 技术通过高温变性、低温退火、适温延伸3 个反应阶段，以待测DNA 片段为模板，合成DNA 新链[2]。传统PCR 技术只能对产物进行定性分析和粗略的定量分析，且实验过程中易受环境污染，这促使人们在原有PCR 技术上进行改进。1995 年美国PE（Perkin Elmer）公司研制出一种新型PCR 定量技术。1996 年美国ABI（Applied Biosystems）公司成功研发并推出实时荧光定量PCR 技术，该技术成功解决了传统PCR 技术无法准确定量以及环境污染导致实验结果假阳性等问题[3]，且目的基因的循环扩增以及产物的定量检测分析同时进行，极大地减少了检测所需时间。实时荧光定量PCR 技术从根本上实现了DNA 的定量检测分析，是基因扩增技术方面的重大突破。

1 实时荧光定量P C R 的特点

（1）通过在PCR 反应体系中加入能标记特定PCR 产物的荧光基团，利用其产生的荧光信号，可实时监测PCR 反应中特定产物每经历一次循环反应所产生的变化量。

（2）荧光染料法和荧光探针法，均可以直接探测目的基因在扩增过程中荧光信号的变化，从而获得PCR 产物的定量结果，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性[4]。

（3）实时荧光定量PCR 仪检测到的数据，通过连接计算机并安装相应分析软件，可以在计算机上通过扩增曲线图、溶解曲线图、标准曲线图，直观反应PCR 产物扩增情况，操作简便，效率高。

（4）RT-qPCR 反应在一个全封闭状态下进行PCR 扩增和产物荧光信号检测分析，有效避免了传统PCR 在开放环境中检测由于环境污染而导致假阳性结果的出现，有效提高了实验的安全性和数据的可靠性。

（5）RT-qPCR 反应可以一次性进行批量样本的PCR 扩增反应，数据通过计算机进行检测分析，极大地减小了人眼观察带来的主观误差。

2 实时荧光定量P C R 的原理

实时荧光定量PCR 是在传统PCR 原理上的进一步延伸。传统PCR 是在体外条件下，加入模板DNA、4 种游离的脱氧核糖核苷酸、2 种引物以及具有热稳定性的DNA 聚合酶，通过高温使DNA 变性解开双链结构、降低温度使引物与模板DNA 的单链进行互补序列结合形成局部双链，最后通过温度升高至72℃左右，以dNTP 为原料，短时间内快速合成大量与模板DNA 互补的新链。实时荧光定量PCR 是在传统PCR 体系的基础上通过加入荧光基团或荧光探针并通过实时荧光定量PCR仪器获得相应荧光积累信号，该荧光信号不断积累形成“S”型曲线即为PCR 反应进程，通过曲线能够计算获得目的样本的初始基因分子数，进而对整个PCR 反应进行定量分析。

实时荧光定量PCR 反应中，由荧光信号积累形成的曲线称为PCR 扩增曲线（图1）。该曲线以PCR 反应循环数作为横坐标，实时荧光信号强度作为纵坐标并引入了基线（baseline）、荧光阈值（threshold）、Ct（threshold cycle）的概念。在PCR 扩增反应中，从扩增反应开始循环到荧光信号呈现指数增长之前的一段时间内，荧光信号呈一条直线，该直线称为基线。荧光阈值是指荧光信号指数增长时的临界值，一般是PCR 反应3～15 个循环荧光信号标准差的10 倍[5]。Ct 值是指PCR 反应试管中荧光信号不断积累达到荧光阈值时所经历的循环次数。Ct 值与PCR 扩增反应的起始目的基因量的对数成反比线性关系，Ct 值越大，起始目的基因量越小[6]。PCR 扩增曲线通过不断收集每一个循环积累荧光信号的强度，根据荧光强度变化对目的基因的PCR 产物量进行实时检测，最终绘制成目的基因的扩增曲线。

图1 实时荧光定量PCR 扩增曲线Fig.1 Amplification curve of RT-qPCR

实时荧光定量PCR 反应中，通过升高温度使PCR 扩增后的目的基因解开双链结构，荧光信号强度快速降低而形成的一条单峰曲线称为溶解曲线（图2）。该曲线以温度作为横坐标，随着时间推移的相对荧光强度的导数作为纵坐标。溶解曲线中通过对PCR 产物不断加热，使扩增产物逐渐解开双链结构，由于荧光基团需要结合到DNA 的双链结构中，才能产生游离状态下10～100 倍的荧光信号[4]，所以当温度升高至Tm 值（DNA 双链碱基对分离50%的温度）时，大量DNA 双链结构被破坏，荧光信号强度急剧下降，从而产生一特征峰，进而绘制成该产物的溶解曲线。不同目的基因所对应的Tm 值也不相同，其荧光信号强度急剧下降的温度也不同。由此可以通过溶解曲线的特征峰判断PCR 产物的特异性[7]，出现单峰说明PCR 扩增产物特异性好，出现杂峰则代表产物受到污染或者有引物二聚体的产生，PCR 扩增产物的特异性较差。

(ⅱ) 对任意F∈CIrr(X),若Fδ∩(∪i∈IUi)=∪i∈I(Fδ∩Ui)≠Ø,则存在i∈I使得Fδ∩Ui≠Ø,由Ui∈τCSI及F∈CIrr(X),F∩Ui≠Ø,于是F∩(∪i∈IUi)≠Ø,从而∪i∈IUi∈τCSI。

图2 实时荧光定量PCR 溶解曲线Fig.2 Melt curve of RT-qPCR

3 实时荧光定量P C R 的定量方法

实时荧光定量PCR 主要有2 种定量方法：绝对定量法（absolute quantification）和相对定量法（relative quantification）[8]。绝对定量法常用已知的样本数据来确定未知样本中某项数值的绝对量；相对定量法则应用测定目的样本和参照样本之间某一数值的相对比率来确定。不同实验可以依据实验目的，选择合适的定量方法进行数据分析。

3.1 绝对定量法

绝对定量法是通过标准曲线法对目的样本的拷贝起始量进行绝对定量。首先，该方法需要确定标准曲线（图3）；在已知标准品浓度的情况下，通常进行10 倍稀释，将稀释后的标准品进行实时荧光PCR 反应获得不同稀释程度下的拷贝数；最后，将标准品拷贝数的对数值作为横坐标，所对应的Ct 值作为纵坐标，绘制出标准曲线并计算出相应的线性回归方程。在定量分析过程中，将目的样品实时荧光定量PCR 反应过程中的Ct 值代入方程中，即可计算出目的样本的起始拷贝数。

图3 实时荧光定量PCR 标准曲线Fig.3 Standard curve of RT-qPCR

3.2 相对定量法

相对定量法是指测定样本中目的基因与另一参照基因两者拷贝数的变化情况。实验过程中不需要知道它们在每个样本中的拷贝数，便可获得目的基因相对比值，然后判断出目的基因在测定样本中表达水平的高低。在使用相对定量法的实验过程中，待测样本的目的基因的拷贝数来自标准曲线。将目的基因的拷贝数与参照基因的拷贝数相除，即可计算出目的基因的相对比值，该比值为参照基因拷贝数的n倍。由于在PCR 反应中，管家基因正常表达且基本不受环境条件影响，因此需要加入管家基因作为标准参照物，从而校正上样过程中存在的实验误差，进而保证相对定量法的真实性和准确性。

4 实时荧光定量P C R 的检测方法

实时荧光定量PCR 具有多种检测方法，随着分子生物学的不断深入发展，相应的科学检测手段也应运而生。迄今为止，科学家已经发明建立了一系列实时荧光定量PCR 技术检测方法。具体分为2 大类，分别是DNA 染料法和荧光探针法[9]。

4.1 D N A 染料法

DNA 染料法通过在PCR 反应体系中添加荧光染料，利用该染料会特异性结合到双链DNA 小沟上并散发出荧光信号的特性[10]，散发出的荧光信号被荧光探测仪器检测，从而实现对PCR 产物扩增的实时检测。实时荧光定量PCR 的DNA 染料包括SYBR Green 染料、SYBR Safe 染料、SYBR Gold 染料与 EB（Ethidium Bromide）染料，实验室常用的荧光染料为SYBR Green I，该染料使用方法简单、技术成熟且成本相对较低。但是DNA 染料法在特异性检测PCR 产物的过程中存在一定不足。由于该方法检测的是PCR 反应体系中所有的双链DNA 分子，即荧光染料会与所有双链DNA 分子小沟结合，当反应过程中有引物二聚体或非特异性扩增的情况发生时，会对实验结果的真实性和准确性产生显著影响。因此，要求实验过程中PCR 反应的退火温度要精确，所使用的引物要具有较高的特异性，在引物设计过程中减少引物二聚体的产生。针对这一问题还可以通过分析溶解曲线来分辨非特异性产物和引物二聚体，进而排除产生的假阳性结果。

4.2 荧光探针法

荧光探针法（Fluorescence Probe）由3 部分组成：荧光报告基团、荧光淬灭基团以及连接基团。在PCR 反应过程中，荧光探针会与目的基因发生特异性结合，在反应起始阶段目的基因和荧光探针的化学结构不会被破坏。此时，根据荧光共振能量转移原理（fluorescence resonance energy transfer，FRET），在荧光探针结构完整的情况下荧光淬灭基团会抑制荧光报告集团所激发出的荧光信号，使荧光信号的强度不会发生变化。当PCR 反应温度升高时，DNA 的双链结构被破坏，特异性结合到DNA上的荧光探针，其上的连接基团功能失效，导致荧光报告基团和荧光淬灭基团之间稳定的能量结构被破坏，荧光淬灭基团无法抑制荧光报告基团释放荧光信号。此时，随着目的基因的大量复制，相应的荧光探针结构被破坏，大量荧光信号被仪器检测到，对应扩增曲线上荧光信号强度开始呈指数增长。简而言之，探针法是利用荧光探针会特异性与目的基因片段结合，并随着扩增产物的增加而不断发射荧光信号来实时检测PCR 反应进程。荧光探针可细分为水解探针、分子信标和杂交探针等。

水解探针法（hydrolysis probes）是一种应用较广的寡核苷酸探针。该荧光探针在5' 端含有荧光报告基团，例如ROX、FAM、VIC、NED 等，在3' 端含有荧光淬灭基团，如TAMRA、BHQ、QSY 等[11]。当PCR 扩增时，荧光探针结构被破坏，报告基团发射的荧光信号无法被淬灭基团抑制，从而使仪器检测到大量荧光信号，即DNA 模板每复制一次，就有一个荧光信号被释放，实现了对PCR 扩增反应的实时监测。由于需要利用Taq 酶5'→3'外切核酸酶活性将荧光探针水解，所以该探针又称为TaqMan 探针。

基于TaqMan 探针而研发的TaqMan-MGB探针，是在TaqMan 探针的3'端除了荧光淬灭基团外，再加入一种可与双链DNA 的螺旋小沟特异性结合的MGB（minor groove binder）分子。MGB 使探针的Tm 值上升10℃左右且探针的长度相对缩短，降低了合成探针所需的费用。另外，由于TaqMan-MGB 探针在3' 端使用非荧光淬灭基团，使得荧光反应的本地信号大大降低，从而提高了反应检测的灵敏度[12]。

4.2.2 分子信标法

分子信标法（molecular beacons）是一种具有茎环发夹结构的单链DNA 分子探针，由美国科学家Tyagi 和Kramer 发明[13]，该探针的两端含有荧光报告基团和淬灭基团。由于分子信标探针呈发夹结构，与TaqMan 探针相比，其5' 端的报告基团与3' 端的淬灭基团距离更近，淬灭基团抑制荧光信号的效果更强。在PCR 反应过程中，分子信标与目标序列的DNA 进行互补结合时，茎环结构被打开，位于5' 端报告基团和3' 端的淬灭基团相分离，淬灭基团的抑制作用随着距离的逐渐增大而减弱，进而产生大量荧光信号。由于分子信标具有极强的特异性，只有与其完全互补配对的DNA 序列存在时，才会与其特异性结合，而释放荧光信号，因此分子信标能够做到准确区分出只有一个核苷酸区别的DNA 序列，常用于鉴定点突变以及对DNA 序列进行特异性检测[14]。此外，发卡式引物、蝎状引物以及LUX引物等荧光标记引物，是基于分子信标原理而开发的一类反应速度快、荧光信号强的联合分子探针系统[15]。

4.2.3 杂交探针法

杂交探针法（hybridization probes）是指在PCR 反应体系中加入2 个特异性探针[16]，其中上游探针的5' 端标记荧光受体基团，下游探针的3'端标记荧光供体基团，2 个基团分别位于2 个不同的探针上，且两者需要结合到目标序列上才可以释放出荧光信号。在PCR 反应进行到退火阶段时，2 个探针一前一后结合到扩增产物上，两者前后相接使受体基团和供体基团距离相近，供体基团激发后产生的荧光能量转移至受体基团，使其发出红色荧光信号从而被仪器检测。当2 个探针分离时，2 个基团距离较远，仪器检测不到受体基团发出的红色荧光信号。杂交探针由于需要2 个探针才能产生荧光信号，其特异性进一步加强，但相应的成本也较高。

5 实时荧光定量P C R 在蜜蜂科学研究中的应用

5.1 蜜蜂疾病诊断

诊断蜜蜂疾病的方法主要有实验室诊断和临床诊断。实验室诊断包括：病原学诊断、解剖学诊断以及血清学诊断[17，18]；临床诊断主要是通过实际观察蜂群整体以及蜜蜂个体（幼虫、蛹、成虫）的形态特征变化来判断。患病蜜蜂通常行动迟缓，蜂体形态和颜色会发生改变[19]。如蜜蜂残翅病毒（Deformed wing virus，DWV）常使成年蜜蜂翅膀卷曲变皱，身体萎缩，体色变暗，失去飞行能力，翅膀常呈现“K”型且只能爬行，1～2 日后死亡；蜜蜂黑蜂王台病毒常使蜂王幼虫的王台变成黑色，患病幼虫多于前蛹期或蛹期死亡，死亡幼虫会形成一个类似于囊状幼虫病的囊；螨害严重常出现幼虫和蜂蛹死亡，在蜂箱周围地面上可见到大量新羽化出房的幼蜂翅膀残缺，到处爬行，衰竭死亡。

随着实时荧光定量PCR 技术的不断开发和应用，蜜蜂疾病的诊断方法研究进入到一个新的阶段[20]。宋战昀等[21]运用TaqMan 探针实时定量PCR 技术成功检测到蜜蜂囊状幼虫病（sacbrood disease，SBV），该方法也适用于蜂蜜、花粉、蜂胶和蜂王浆等蜂产品中SBV 的检测，为蜜蜂及相关蜂产品的质量安全提供了检测手段，为临床快速确诊蜜蜂囊状幼虫病，及时用药治疗并防止用药超标导致的药物残留提供理论和技术支撑。张体银等[22]建立了蜜蜂克什米尔病毒（Kashmir bee virus，KBV）的Taq-Man 探针实时荧光定量方法，为KBV 的快速检测提供了技术支撑；与此同时，张体银等[23]建立了蜜蜂急性麻痹病毒（Acute Bee Paralysis Virus，ABPV）的TaqMan 探针实时荧光定量方法，为ABPV 的精确检测提供了技术支持。杨倩等[24]通过TaqMan 探针实时定量PCR 技术原理，成功建立黑蜂王台病毒(Black queen cell virus，BQCV)的快速检测手段，为控制黑蜂王台病毒的传播和提高蜂王幼虫成活率提供了技术保障。

王琛等[25]运用TaqMan-MGB 探针建立的实时荧光定量RT-PCR 成功对DWV 进行实时检测，该方法与王蕾等[26]通过使用SYBR Green I荧光染料建立的实时荧光定量RT-PCR 检测方法相比较，TaqMan-MGB 探针法能够检测到拷贝数10 以下的病毒载量，灵敏度更高。该方法还具有背景信号强度低、探针引物精确度高、特异性强，以及操作简便、速度快等特点。TaqMan-MGB 探针的研究开发，为DWV的病原检测及其流行病学调查提供了技术支撑。

5.2 蜜蜂病理学研究

美洲幼虫腐臭病（American foulbrood，AFB）又称“烂子病”，是一种主要危害蜜蜂幼虫并导致幼虫虫体腐烂的疾病。该病易造成幼虫死亡以及蜂群整体群势下降，一旦发生难以彻底清除。AFB 是由幼虫芽孢杆菌引发的疾病，控制病因是一种有效的防范措施。何晓杰等[27]运用实时荧光定量PCR TaqMan 探针法对幼虫芽孢杆菌进行定量检测分析，进而监控蜜蜂体内AFB 的含量。该方法的建立能够为AFB 的早期诊断和预防提供信息参考。

欧洲幼虫腐臭病(European foulbrood，EFB)的致病菌为蜂房蜜蜂球菌，其余细菌如幼虫芽孢杆菌等为次生菌。该病多发于群势较弱的蜂群，幼虫染病后虫体失去光泽并发黄，病虫死亡后会散发酸臭气味，影响蜂群群势。何晓杰等[28]通过实时荧光定量PCR 方法对蜜蜂欧洲幼虫腐臭病病原菌进行定量分析，为蜂产品中蜂房蜜蜂球菌的检测以及EFB 的预防提供了技术指导。

5.3 蜜蜂基因功能表达研究

实时荧光定量PCR 技术是一种研究基因功能表达的良好平台，通过该技术能检测和分析目的基因在不同组织的时空表达模式，从而为进一步阐明目的基因在样本中的生物学功能提供理论依据。

王宇飞等[29]和齐磊等[30]运用实时荧光定量PCR 检测了意大利蜜蜂不同日龄的工蜂触角中化学感受蛋白基因 CSPs家族（Amel-CSP1～Amel-CSP6，其中Amel-CSP5 表达稳定无特异性)的表达情况，结果显示Amel-CSP1、Amel-CSP6 可能与意蜂工蜂工作行为转变有关；Amel-CSP2 则与工蜂羽化和信息素的接受有关；Amel-CSP3 在蜜蜂搜索蜜源过程中具有一定的气味运输功能；Amel-CSP4可能与信息素的传递和运输有关。王琦[31]等通过实时荧光定量PCR 技术测定了西方蜜蜂各级型不同发育阶段昆虫血淋巴19 k Da 蛋白（HP19）的转录水平，揭示了该蛋白在西方蜜蜂变态发育期起重要调控作用。刘川东等[32]应用实时荧光定量PCR 测定西方蜜蜂蜕皮激素早期应答因子ecr 和usp 在蜜蜂不同级型、不同发育时期的表达水平，揭示了蜕皮激素对蜜蜂生长发育、蜕皮变态有调控作用。李晓燕等[33]利用实时荧光定量PCR 技术对MRJP7（王浆蛋白基因家族成员之一）在意大利蜜蜂各级型不同发育阶段、不同组织中进行定量检测分析，结果表明MRJP7 在工蜂羽化后9 日龄前后的哺育蜂王浆腺和头部高水平特异性表达，这与工蜂会哺育幼虫和蜂王的行为相适应，证明MRJP7 具有一定的营养功能。

5.4 蜂产品运用研究

实时荧光定量PCR 技术在蜜蜂蜂产品研发中也有一定程度的研究。王芳[34]使用实时荧光定量PCR 技术检测了不同浓度下水溶性壳聚糖对蜂花粉源菌群的抑制作用，结果表明将壳聚糖运用到蜂花粉中可抑制菌群生长，并为由蜂花粉引起的蜜蜂疾病提供预防作用，为相关药物的开发提供理论基础。柳吉芹等[35]利用实时荧光定量PCR TaqMan 探针法，通过设计2 种针对中蜂和意蜂的特异性探针，对中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜之间MRJP2 的分子量进行检测鉴定。PCR 扩增结果显示大多数中蜂蜂蜜存在掺假现象。研究提供的鉴别方法能够快速有效地区分中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜，并为蜂产业的良好健康发展提供了方法。

6 展望

实时荧光定量PCR 技术自发明至今，在蜜蜂疾病诊断检测方面已得到广泛应用。蜜蜂病毒如：DWV、SBV、KBV 等，其病原体的检测诊断已得到较为充分的研究。由于实时荧光定量PCR 技术能够定量测定基因量且具有检测速度快、精度高、误差小、特异性强等特点，目前已经成为分子生物学相关研究的重要技术。随着实时荧光定量PCR 技术的不断更新换代，仪器操作更加简便、实验成本降低、反应灵敏度大幅提高，结合生物芯片技术、肽核酸技术、微解剖技术等其他先进检测技术，实时荧光定量PCR 技术在蜜蜂科学研究中将会有更为广阔的应用前景。