红麻WRKY基因家族鉴定及其盐胁迫下的表达分析

李 辉，康泽培，邱财生，戴志刚，邱化蛟

(1.中国农业科学院 麻类研究所，湖南 长沙 410205；2.湖南文理学院 生命与环境科学学院，湖南 常德 415000)

WRKY转录因子家族是植物体内最大的转录因子家族之一，参与植物生物/非生物逆境胁迫响应、生长发育等过程，是植物调控网络重要的组成部分[1-2]。红麻是重要的天然纤维作物之一，主要用于纺织、纸浆、生物质能源等方面[3-4]。红麻种植以盐碱地、沿海滩涂、干旱坡地等非粮食耕地为主。因此，筛选和鉴定参与红麻响应非生物胁迫过程的WRKY基因家族成员，对阐明红麻耐逆机理、培育耐逆品种、维持红麻产业的可持续发展具有重要意义。

WRKY转录因子家族成员都具有一段保守的氨基酸序列，N-端具有标志性的高度保守序列WRKYGQK，C-端具有C2H2或C2HC这2种锌指结构。自从第一个WRKY转录因子SPF1[5]从甘薯中克隆获得后，人们陆续从拟南芥[6]、水稻[7]、小麦[8]、棉花[9]、红麻[10]等不同作物获得WRKY家族成员。WRKY转录因子家族参与植物的生长发育、生物、非生物逆境胁迫等多种过程，有的WRKY转录因子家族成员在植物响应盐胁迫过程中具有重要作用。魏晓爱等[11]通过实时荧光定量PCR发现，72个拟南芥WRKY基因家族成员中有30个盐胁迫响应基因，其中上调表达基因23个，下调表达基因7个。在250 mmol/L的NaCl胁迫下，高粱SbWRKY71基因的表达量呈现出先上升后下降的表达趋势，且在胁迫9 h表达量达到最高[12]。盐胁迫下，与野生型烟草相比，在过表达小麦TaWRKY46基因的烟草植株中可溶性糖和可溶性蛋白含量显著上升，植株的鲜质量明显增加，可见，小麦TaWRKY46基因增强了转基因烟草植株的耐盐性[13]。郭玉敏等[14]研究表明，盐胁迫下，玉米ZmWRKY101基因的表达量显著提高，通过提高转ZmWRKY101基因拟南芥植株抗氧化酶的活性，增强转基因植株的耐盐性。综上所述，WRKY转录因子家族成员在植物响应盐胁迫过程中具有正向/负向的调控作用。目前，关于红麻WRKY基因家族的系统分析及其盐胁迫下的表达分析尚未见报道。

本研究拟用生物信息学筛选、鉴定出红麻WRKY基因家族成员，并通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)技术分析盐胁迫下WRKY基因家族成员的表达情况，旨在为进一步研究红麻WRKY基因家族成员的生物学功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料的种植

试验材料中红麻16号的种子由中国农业科学院麻类研究所提供。挑选籽粒饱满的种子播种于湖南文理学院温室，待红麻幼苗长到四叶一心时移栽到水培室进行培养，培养7 d后选取健壮的红麻幼苗45株，进行NaCl胁迫处理，NaCl的浓度梯度为0，50，100，200，400 mmol/L，每个处理3株，3个生物学重复，胁迫处理7 d后，分别选取每个浓度梯度红麻幼苗的根、茎、叶，液氮速冻后放入超低温冰箱保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 红麻WRKY家族成员的鉴定 从国家基因组科学数据中心(National Genomics Data Center)下载红麻全基因组的核苷酸序列和蛋白质氨基酸序列[15]，利用Blast软件构建本地蛋白数据库，以红麻HcWRKY71[10]蛋白的氨基酸序列为比对序列，利用Blast本地比对功能，在本地建立的蛋白库中进行比对，获取红麻WRKY候选蛋白，同时从Pfam数据库(http：//pfam.xfam.org/)下载WRKY基因家族保守结构域的隐马尔可夫模型文件，利用HMMER 3.1软件在红麻本地蛋白数据中进行BlastP搜索，获取红麻WRKY候选蛋白，去掉重复序列后将二者获得序列全部作为WRKY基因家族的候选序列。然后利用在线软件SMART(http：//smart.embl.de/)和NCBI网站的CD-Search Tool 对基因家族候选序列的WRKY结构域进行预测，去掉不具有WRKY结构域的候选序列，最后获得红麻WRKY基因家族序列，将获得的WRKY基因家族序列逐条在NCBI网站进行 BlastP序列比对并命名。

1.2.2 红麻WRKY家族成员系统进化树的构建 从网站(https：//www.arabidopsis.org/)下载拟南芥WRKY家族成员核苷酸序列并翻译成蛋白质氨基酸序列，利用MEGA 11.0软件，采用邻近法构建拟南芥和红麻2个物种WRKY基因家族系统发育进化树。

1.2.3 红麻WRKY家族基因保守基序和蛋白理化性质分析 利用在线网站MEME(https://meme-suite.org/)对红麻WRKY家族基因进行保守基序分析，同时利用在线网站ExPASy(https：//www.expasy.org/)检测WRKY家族成员氨基酸序列的等电点(PI)、蛋白质分子量(MW)和氨基酸数目(aa)。

1.2.4 盐胁迫下红麻 WRKY家族的实时荧光定量PCR分析 利用植物总RNA提取试剂盒分别提取不同NaCl浓度胁迫下红麻植株根、茎、叶的总RNA，并反转录成cDNA作为实时荧光定量PCR的模板。根据WRKY家族基因的核苷酸序列，利用Primer Premier 6.0设计引物(表1)。以Hcβaction基因为内参基因，采用qRT-PCR技术对在不同NaCl浓度胁迫下WRKY家族成员的表达特征进行分析，每个反应设置3次重复。qRT-PCR的反应体系：上下游引物各0.5 μL，qPCRmix 10 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O补至20 μL。qRT-PCR的2步法扩增程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，45个循环;溶解曲线标准程序：95 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s。

表1 实时荧光定量PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequence

2 结果与分析

2.1 红麻WRKY家族基因成员鉴定及其理化性质分析

通过Blast和HMMER序列比对，结合WRKY保守结构域分析，最后获得33个WRKY家族成员。将33个WRKY家族成员逐条在NCBI网站进行Blast比对分析，根据最小E值对其进行系统命名。由表2可知，33个WRKY家族成员不均匀地分布在12条染色体上。其中，7，6号染色体分布的WRKY家族成员最多，各5个成员;5，8号染色体分布的WRKY家族成员最少，各1个成员；3，6，7号染色体分别存在同一基因的2个拷贝，分别是HcWRKY71-1、HcWRKY71-2；HcWRKY72-1、HcWRKY72-2；HcWRKY40-1、HcWRKY40-2。而HcWRKY75基因的2个拷贝分别位于18，4号染色体上。这可能是由基因组复制事件导致的结果。

WRKY家族成员理化性质鉴定分析结果如表2所示，该基因家族多肽链氨基酸数目为87～1 142个；等电点为5.26～10.18；蛋白质分子质量为10.2～132.7。

2.2 红麻WRKY家族成员系统进化树分析

利用MEGA 11.0对72个拟南芥WRKY家族成员和33个红麻WRKY家族成员的氨基酸序列构建系统发育进化树，结果如图1所示。由图1可知，2个物种的WRKY家族成员分成了3个类群Group Ⅰ、Group Ⅱ、Group Ⅲ，其中Group Ⅲ包含了5个亚组。红麻WRKY家族成员在每个分支都有分布，其中，Group Ⅰ和GroupⅢ-a全部为红麻WRKY家族成员。红麻WRKY家族成员中的HcWRKY13、HcWRKY31、HcWRKY33、HcWRKY40-2分布在Group Ⅱ，与其相对应的拟南芥的WRKY家族成员则分布在Group Ⅲ。这可能是由于红麻属于锦葵科木槿属，而拟南芥属于十字花科鼠耳芥属的缘故。

表2 WRKY家族成员及其理化性质分析Tab.2 WRKY family members and analysis of their physicochemical properties

2.3 WRKY家族成员保守基序分析

由图2可知，33个WRKY家族成员都含有WRKY保守基序，其中有5个WRKY家族成员含有2个WRKY保守基序。这一结果与系统进化树的分析结果相似，具有2个WRKY保守基序的WRKY家族成员(HcWRKY2、HcWRKY3、HcWRKY4、HcWRKY58)都位于Group Ⅱ；其余28个WRKY家族成员都含有1个WRKY保守基序，分布在系统进化树的不同分支上。

2.4 WRKY家族成员在不同器官的表达分析

采用荧光定量PCR技术，对33个红麻WRKY家族成员在不同器官的表达特征进行分析，成功检测到26个WRKY家族成员基因在不同器官的表达变化，分别是HcWRKY2、HcWRKY3、HcWRKY4、HcWRKY7、HcWRKY9、HcWRKY11、HcWRKY13、HcWRKY17、HcWRKY24、HcWRKY31、HcWRKY32、HcWRKY33、HcWRKY39、HcWRKY40-1、HcWRKY40-2、HcWRKY43、HcWRKY44、HcWRKY47、HcWRKY53、HcWRKY57、HcWRKY58、HcWRKY65、HcWRKY71-1、HcWRKY72-1、HcWRKY72-2、HcWRKY74。未能检测到的WRKY家族成员有7个，分别是HcWRKY23、HcWRKY26、HcWRKY46、HcWRKY51、HcWRKY71-2、HcWRKY75-1、HcWRKY75-2。其中在根、茎、叶表达量没有显著差异的WRKY家族成员有8个，分别是HcWRKY4、HcWRKY7、HcWRKY39、HcWRKY43、HcWRKY44、HcWRKY53、HcWRKY71-1、HcWRKY72-1(图3)；在根和茎的表达量低于叶片的WRKY家族成员有5个，分别是HcWRKY2、HcWRKY32、HcWRKY33、HcWRKY47、HcWRKY74，其中在根中表达量极显著低于叶片的是HcWRKY2、HcWRKY32、HcWRKY33、HcWRKY74。在茎中表达量极显著低于叶片的是基因HcWRKY33，显著低于叶片的基因是HcWRKY47、HcWRKY32。在根中表达量显著低于叶片的基因是HcWRKY72-2(图4)。在茎中表达量高于叶片的WRKY家族成员有12个，其中极显著高于叶片的是HcWRKY9、HcWRKY13、HcWRKY31、HcWRKY40-1、HcWRKY40-2、HcWRKY57、HcWRKY65基因，显著高于叶片的基因是HcWRKY3、HcWRKY17(图5)。综上所述，红麻WRKY家族成员在根、茎、叶都有表达，都属于组成型表达基因。

HcWRKY.红麻WRKY基因家族；AtWRKY.拟南芥WRKY基因家族。 HcWRKY.WRKY family members in kenaf；AtWRKY.WRKY family members in Arabidopsis thaliana.

图2 红麻WRKY家族成员保守基序分布Fig.2 Distribution of conserved motifs of WRKY family members in kenaf

图3 在不同器官表达量无显著差异的WRKY家族成员Fig.3 WRKY family members with no significant difference in expression in different organs

以基因在叶片的表达量为对照进行方差分析，小写字母表示P<0.05；大写字母表示P<0.01。图5同。 The expression of genes in leaves was used as the control for analysis of variance，lowercase letters indicated P<0.05； capital letters indicate P <0.01.The same as Fig.5.

图5 在茎表达量上调的WRKY家族成员Fig.5 WRKY family members with up-regulated expression in stems

2.5 盐胁迫下WRKY家族成员的表达分析

以叶片cDNA为PCR模板，采用荧光定量PCR技术，对成功检测到的26个WRKY家族成员在盐胁迫下的表达特征进行分析，结果发现，不同的WRKY家族成员具有不同的表达特征。

2.5.1 盐胁迫下基因表达量一直上升的WRKY家族成员 盐胁迫下，随着NaCl浓度的升高，基因表达量一直上升的WRKY家族成员有5个，分别是HcWRKY17、HcWRKY24、HcWRKY40-1、HcWRKY53、HcWRKY71-1。由图6可知，当NaCl浓度为400 mmol/L时，HcWRKY71-1基因表达量上调幅度最大，为对照的42倍，其次是HcWRKY53、HcWRKY40-1、HcWRKY24、HcWRKY17。与对照相比，这5个WRKY家族成员表达量上调幅度都具有极显著差异水平(P<0.01)。由此推测，这5个WRKY家族成员在红麻响应盐胁迫的过程中具有正向调控作用。

2.5.2 盐胁迫下基因表达量先上升后下降再上升的WRKY家族成员 盐胁迫下，随着NaCl浓度的升高，基因表达量先上升后下降然后再上升的WRKY家族成员有5个，分别是HcWRKY39、HcWRKY40-2、HcWRKY47、HcWRKY58、HcWRKY72-1。由图7可知，在低浓度NaCl胁迫下(50 mmol/L)，这5个WRKY家族成员基因的表达量均呈现不同程度的上调，随着NaCl浓度的升高，基因的表达量均呈现下降的趋势。当NaCl浓度为400 mmol/L时，HcWRKY47、HcWRKY58、HcWRKY72-1基因的表达量则进一步上升，其中HcWRKY72-1基因的表达量是对照表达量的9倍多，其次依次是HcWRKY47、HcWRKY58。由此推测，这5个WRKY家族成员在红麻响应盐胁迫过程中具有正向调控作用。

以0 mol/L NaCl胁迫时基因的表达量为对照进行方差分析，小写字母表示P<0.05；大写字母表示P<0.01。图7—10同。 The gene expression under 0 mol/L NaCl stress was used as the control for analysis of variance，lowercase letters indicated P<0.05； capital letters indicate P <0.01.The same as Fig.7—10.

图7 盐胁迫下基因表达量先上升后下降再上升的WRKY家族成员Fig.7 WRKY family members whose gene expression first increased，then decreased and then increased under salt stress

2.5.3 盐胁迫下基因表达量先上升后下降的WRKY家族成员 随着NaCl浓度的升高，基因表达量先上升然后下降的WRKY家族成员有12个，分别是HcWRKY2、HcWRKY4、HcWRKY7、HcWRKY13、HcWRKY31、HcWRKY32、HcWRKY33、HcWRKY43、HcWRKY44、HcWRKY65、HcWRKY72-2、HcWRKY74(图8)。在NaCl浓度为50 mmol/L时，基因表达量达到最高值的有HcWRKY4、HcWRKY13、HcWRKY31、HcWRKY33、HcWRKY43、HcWRKY72-2、HcWRKY74；在NaCl浓度为100 mmol/L时，基因表达量达到最高值的有HcWRKY4、HcWRKY44、HcWRKY65；在NaCl浓度为200 mmol/L时，基因表达量达到最高值有HcWRKY2、HcWRKY7、HcWRKY32。与对照相比，基因表达量的最高值均具有极显著差异(除HcWRKY4外)。由此可知，这12个WRKY家族成员表达量上调达各自峰值时对应不同的NaCl浓度，且在红麻响应盐胁迫过程中均具有正向调控作用。

图8 盐胁迫下表达量先上升后下降的WRKY家族成员Fig.8 WRKY family members whose expression first increased and then decreased under salt stress

2.5.4 盐胁迫下表达量先下降后上升的WRKY家族成员 随着NaCl浓度的升高，基因表达量先下降然后上升的WRKY家族成员有1个，即HcWRKY3。由图9可知，在浓度NaCl胁迫时(50，100 mmol/L)该基因表达量下降，与对照相比没有显著差异，当NaCl浓度升高时(200，400 mmol/L)该基因表达量上升，与对照相比具有极显著差异。推测该基因在红麻响应盐胁迫过程中具有正向调控作用。

2.5.5 盐胁迫下基因表达量一直下降的WRKY家族成员 随着NaCl浓度的升高，基因表达量一直下降的WRKY家族成员有3个，分别是HcWRKY9、HcWRKY11、HcWRKY57。由图10可知，当NaCl浓度为400 mmol/L，HcWRKY11基因表达量下调幅度最大，为对照的1/16倍，其次是依次HcWRKY57、HcWRKY9。与对照相比，这3个WRKY家族成员表达量下调幅度具有极显著差异水平。由此推测，这3个WRKY家族成员在红麻响应盐胁迫的过程中具有负向调控作用。

图9 盐胁迫下表达量先下降后上升的WRKY家族成员Fig.9 WRKY family members whose expression first decreased and then increased under salt stress

图10 盐胁迫下表达量一直下降的WRKY家族成员Fig.10 WRKY family members with decreased expression under salt stress

综上所述，盐胁迫下，WRKY基因表达量出现上调的家族成员有23个，表达量出现下调的家族成员有3个，表达量上调的WRKY基因可能具有正向调控作用，表达量下调表达的WRKY基因可能具有负向调控作用。

3 结论与讨论

3.1 红麻WRKY家族成员分子特征

WRKY家族成员参与植物的不同逆境调控网络，目前很多植物已经完成了WRKY家族成员的系统分析，如拟南芥[16-18]、水稻[19]、小麦[20]、杨树[21]、石榴[22]。然而对红麻WRKY家族的系统研究还未见报道。本研究通过红麻基因组Blast和HMMER序列比对，结合WRKY保守结构域分析，最后获得了33个WRKY家族成员，远少于棉花[23]的109个WRKY家族成员。这表明，与棉花相比，红麻WRKY基因家族在进化过程中基因丢失现象严重，在西瓜[24]和黄瓜[25]WRKY家族成员研究者也有相似的结果。不同的WRKY家族成员之间在蛋白质理化性质方面存在一定的差异，比如氨基酸数目、蛋白质分子量、理论等电点。这些理化性质的差异是每个WRKY家族成员具有不同生物学功能的分子基础。系统进化树分析发现，3个红麻WRKY家族成员HcWRKY11、HcWRKY32、HcWRKY46没有与拟南芥的WRKY家族成员聚类到一起。同时分别来源于红麻和拟南芥的WRKY家族成员在同一进化树的分支中存在散在的分布情况，说明大多数同源基因在这2个物种适应各自环境的进化过程中发生了一定程度的变异。

3.2 红麻WRKY家族成员的盐胁迫响应

WRKY转录因子家族在植物响应盐胁迫过程中具有重要的调控作用。如在拟南芥中过表达棉花GmWRKY34基因能够显著提高转基因拟南芥的耐盐性[26]，在烟草中过表达棉花GmWRKY41基因能够显著提高转基因烟草的耐盐性[27]。本研究发现，33个WRKY家族成员中有26个被成功检测到，且全部是盐胁迫诱导表达基因，其中23个WRKY家族成员具有正向调控作用，3个WRKY家族成员具有负向调控作用。这就是红麻耐盐性强的一个重要因素。

盐胁迫下，红麻HcWRKY71-1基因的表达量随着NaCl浓度的增加而逐渐上调，这与盐胁迫下棉花GhWRKY71[28]基因的表达相似；HcWRKY4基因的表达量随着NaCl浓度的增加呈现出先上升后下降的表达趋势，同样甘蔗ScWRKY4[29]基因的表达受到盐胁迫的诱导；红麻HcWRKY33基因和拟南芥AtWRKY33[30]基因都是盐胁迫诱导表达基因。可见，同源基因在不同的物种中具有相似的生物学功能，这将为红麻WRKY家族成员的功能研究提供理论参考。

本研究利用生物信息学技术鉴定出了33个WRKY家族成员，不均匀地分布在12条染色体上。盐胁迫下，通过实时荧光定量PCR技术成功检测到26个WRKY家族成员，其中23个具有正向调控作用，3个具有负向调控作用。这将为进一步研究红麻WRKY家族成员的生物学功能奠定坚实的基础。