一种新型生物反应器的基因测序分析
2022-09-14芦旭飞叶天彤
杜 巍 王 坤 芦旭飞 叶天彤
（北京京环新能环境科技有限公司，北京 100020）
0 引言
垃圾填埋渗沥液通常指填埋过程中及雨水渗漏产生的液体。基因测序是指通过对微生物的遗传基因进行测定来确定环境中微生物的种类和浓度的一种分子生物学分析方法。16S核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）测序是一种特殊的基因测序方式，其中16S指的是细菌RNA的沉降系数，即颗粒在单位离心力场中粒子的移动速度，对大分子物质沉降系数通常在10 s~13 s左右。对细菌的基因组织进行离心沉降后，按照沉降系数可分为3种，即5S、16S和23S。细菌的16S RNA高变区具有明显的细菌种属特征，便于区分不同细菌。因此对细菌16S RNA高变区的扩增产物进行高通量测序，再将所得结果与数据库比较，可以得到样品中细菌的菌群结构和多样性及分布特征。
胡小松等对复齿鼯鼠干燥粪便样品中微生物16S RNA基因进行测序，发现厚壁菌门（87.68%±2.68%）、拟杆菌门（7.62%±3.74%）为优势菌门。李俊峰基于16S RNA分析流程找出了在胃炎病人和健康人中丰度显著差异的物种。郝兵兵从膜生物反应器（membrane bio-reactor，MBR）反应器中分离纯化、筛选出一株假单胞菌，该菌株对水产养殖废水中的硝酸盐有较好去除效果。
1 材料与方法
1.1 测试方法与流程说明
1.2 样品分组与多样性分析方法
该研究将对接种菌种样品、实际生物反应器样品、曝气池样品3类样品进行16S RNA基因测序，得到样品信息库，最终根据结果进行多样性分析。
对所测样品根据其来源分为A、B、C共3组，其中A组为接种菌种样品组，B组为实际生物反应器样品组，C组为曝气池样品组。菌种原样标记为ACJ1；生物反应器段标记为BZP1、BZP2；曝气池段标记为CBQ1、CBQ2、CBQ3和CBQ4，具体的取样分组信息见表1。
表1 16S RNA测序分组情况表
这里采取组间进行A组与B组BZP1、A组与C组CBQ2、A组与C组CBQ4共3次对比。这一过程将依次采取赵式（the chao1 index，Chao1）菌群丰富度指数曲线、香农-威纳（shannon-wiener，Shannon）多样性指数曲线、辛普森（ginisimpson，simpson）多样性指数曲线以及准确覆盖率（Good´s
该研究是针对北京某填埋场的生物反应器渗沥液处理设施而进行的。该处理设施采用生物反应器+曝气池+膜处理工艺对填埋场渗沥液进行处理，其中生物反应器+曝气池为前端生化处理部分，具体流程图详如图1所示。该研究旨在通过16S RNA基因测序研究能够适应垃圾渗沥液这种高盐高氨氮环境的微生物的种群分布及主要功能菌。coverage）测序深度曲线对OTU数据测定结果进行全面和准确性检验，确保后续利用OTU数据得到正确的分析结论。
图1 生物反应器-膜处理工艺流程示意图
chao1指数稀释曲线指的是用chao1算法估计群落中含OTU数目的指数，是一种生态学中常用的估计物种总数的方法，如公式（1）所示。
式中：1是估计的OTU数；是实际观察的OTU数；是只有1条序列的OTU数目；是只有2条序列的OTU数目。
shannon-wiener指数稀释曲线，反映样品中微生物多样性的指数，利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。
计算指数如公式（2）所示。
式中：为-指数。各种之间，个体分配越均匀，值就越大；为个体序号。为样品中属于第种的个体的比例，如样品总个体数为，第种个体数为，则=/。
Simpson指数稀释曲线在生态学中常常用来定量描述一个区域的生物多样性。当样品中只有1个物种时（即所有序列都代表同一个物种），值为0；当样品中各物种均匀分布时，值为1。Simpson指数值越大，越均匀，群落多样性越高。Simpson指数计算公式如公式（3）所示。
式中：为Simpson指数；n为样品中含条序列的OTU 数；为样品总序列数。
Good´s coverage指数稀释曲线用于评估测序结果代表的菌种群落中物种的总数，常用于评估测序深度是否足够。其计算公式如公式（4）所示。
式中：为Good's coverage指数；为样本中OTUs的数量；为OTUs总丰度。
2 组间对比分析
2.1 ACJ1与 BZP1对比分析
ACJ1与BZP1这2组数据的多样性对比见表2。从表2中可以明显看出，ACJ1与BZP1从多种测试方法角度来看均存在较大差异。实际操作过程中，ACJ1为培养初期所使用的菌种，BZP1为经过长时间驯化后实际生物反应器工艺段中存在的菌种。显然，实际过程中菌种组成已发生了较大改变，因此后续将单独探究BZP1为代表的生物反应器工艺段中的优势菌，以探究渗沥液处理中的脱氮优势菌。
表2 ACJ1与BZP2测定结果对比表
2.2 ACJ1与 CBQ2对比分析
ACJ1与CBQ2两组数据的多样性对比见表3。从表3中可以明显看出，ACJ1与CBQ2从多种测试方法角度来看均存在较大差异。实际操作过程中，ACJ1为培养初期所使用的菌种，CBQ2为经过长时间驯化后曝气池工艺段中存在的菌种。显然，实际过程中菌种组成已发生了较大改变，因此后续将单独探究CBQ2为代表的曝气池工艺段中的优势菌，以探究渗沥液处理中的脱氮优势菌。
表3 ACJ1与CBQ2测定结果对比表
上述分析证明所得OTU数据准确性和多样性满足后续分析要求，因此进入下一步分析阶段。
3 丰度分析
3.1 接种原样丰度图
接种原样分析图见图2及表4。
图2 接种原样菌种丰度分布图
表4 接种原样菌种占比表
从图2及表4中可以看出，主要优势门类为变形菌门和厚壁菌门，其中厚壁菌门主要为梭状芽胞杆菌纲、杆菌纲。
这里对厂家接种样品的思路做如下猜想。1） 先利用变形菌门内的各种细菌的不同适应性，在不良水质下迅速繁殖并有效提升污泥浓度，与此同时若生存环境仍过于恶劣，芽孢杆菌释放芽孢，并进入休眠状态，等待后续环境改善后重新恢复活力。2） 变形菌门内的各种细菌大量繁殖后逐步改善水质，进入生长稳定期，同时，芽孢杆菌开始恢复活力，进入繁殖阶段并进一步改善水质。3） 主要菌种繁殖基本结束，进入稳定运行状态，工艺出水逐渐稳定。
3.2 生物反应器样品分析
生物反应器样品丰度图见图3及表5。
从图3及表5中可以看出，主要优势门类为变形菌门和似杆菌门，其中似杆菌门主要为黄杆菌纲、似杆菌纲和嗜盐细菌纲。变形菌门为接种样品中中添加较多的部分，该部分的存在符合正常规律。接种样品中本不属于优势菌种的似杆菌最终数量超越了厚壁菌成了第2类优势菌种，这说明安定填埋场的水质和处理环境较为适宜似杆菌门的生长，而厚壁菌门的细菌相对不适应上述环境，因此推断安定卫生填埋场生物反应器工艺实际对TN去除占主导作用的杆状细菌主要为似杆菌门类的各类细菌，如后续需要加强处理效果，可考虑适当投加对应菌种。
表5 生物反应器菌种占比表
图3 生物反应器菌种丰度分布图
3.3 曝气池样品分析
曝气池样品丰度图见表6。
表6 （a）曝气池1-1菌种占比表
表6 （b）曝气池1-2菌种占比表
表6 （c）曝气池1-3菌种占比表
从表6可以看出，主要优势门类为变形菌门和似杆菌门，其中似杆菌门主要为黄杆菌纲、似杆菌纲和嗜盐细菌纲。变形菌门为接种样品中中添加较多的部分，该部分的存在符合正常规律。与转盘情况类似，接种样品中本不属于优势菌种的似杆菌最终数量超越了厚壁菌成了第2类优势菌种，进一步证实了安定填埋场的水质和处理环境更适宜似杆菌门的生长。同时虽然图中没有显示，但在表6（a）和表6（d）的结果中都存在含量为0.5%以下的产甲烷菌，证明控制溶解氧后即使不接种也能够产生相关厌氧细菌，只是浓度受限。同时参考处理效果可以看出，曝气池和生物反应器菌种类别和含量基本相近，只是因为曝气量和整体结构不同而导致处理效果有所差异。
表6 （d）曝气池1-4菌种占比表
4 结论
接种原样中主要优势门类为变形菌门和厚壁菌门，其中厚壁菌门主要为梭状芽胞杆菌纲、杆菌纲；生物反应器样品中主要优势门类为变形菌门和似杆菌门，其中似杆菌门主要为黄杆菌纲、似杆菌纲和嗜盐细菌纲；曝气池样品中主要优势门类为变形菌门和似杆菌门，其中似杆菌门主要为黄杆菌纲、似杆菌纲和嗜盐细菌纲。曝气池和生物反应器菌种类别和含量基本相近，只是因为曝气量和整体结构不同而导致处理效果有所差异；在曝气量充足的情况下，似杆菌将逐渐取代厚壁菌成为生物除氮作用的优势菌种。
