有机废料合成聚羟基脂肪酸酯的研究进展

2022-09-12刘泽清宋秀兰

应用化工 2022年7期

刘泽清，宋秀兰

(太原理工大学环境科学与工程学院，山西太原 030600)

聚羟基脂肪酸酯(PHA)作为一种生态塑料，具有与传统石油基塑料相似的物化特征，同时易被微生物降解[1]，可作为传统塑料的替代品。PHA具有优越的热加工性、生物降解性和生物相容性，广泛应用于生物医学设备、电子、建筑、汽车、包装和农业等领域[2]。

PHA是一种微生物聚酯，在许多原核生物中以胞内颗粒的形式积累[3]，主要用作贮藏材料应对外部碳源不足。这些微生物在碳源充足但营养条件受到限制的条件下(如氮限制、磷限制、溶解氧限制等)合成PHA。2021年3月，我国明确把碳中和纳入生态文明建设整体布局，而PHA的生产有利于实现碳中和的目标。为了降低成本，企业通常选择废弃物(如油脂、甘油、木质纤维素、糖蜜等)直接或发酵作为碳源，这一过程既可以实现废物利用，又可以减少甲烷的排放。然后，利用筛选出的产PHA细菌摄取碳源合成PHA；最后提纯富集出PHA。而PHA生产成本至少是传统塑料如聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)或聚乳酸(PLA)的3倍[4]，故推动PHA的深入研究刻不容缓，这对构建环境友好型社会有重要意义。

1 聚羟基脂肪酸酯(PHA)的特征

PHA主要由单体羟基脂肪酸(HA)聚合而成[5]，根据其单体中碳原子的数目，可分为短链PHA(Scl-PHA)、中链PHA(Mcl-PHA)和长链PHA(Lcl-PHA)。短链PHA的单体有3～5个碳原子，包括3-羟基丁酸盐(3HB)和3-羟基戊酸盐(3HV)等；中链PHA的单体有6～14个碳原子，包括3-羟基辛酸盐(3HO)、3-羟基壬酸盐(3HN)和3-羟基己酸盐(3HHx)等；长链PHA的单体则具有15个以上的碳原子。短链PHA具有较好的晶体力学性能，但脆性大。中链PHA在零下也不会变脆，可作为优异的弹性材料和生物橡胶，但其熔化温度大多接近室温[6]。根据PHA的单体是否均一，可将PHA分为均聚物和共聚物[7]。对于当前已知的PHA聚合物，只有PHB和PHV属于均聚物，其他均属于共聚物，如3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯共聚物(PHBV)。研究表明，与均聚物相比，共聚物表现出更优异的性能[8]，故当前共聚物的研究受到越来越多的关注。

生物体内积累的PHA颗粒，称为碳小体[9]，一般呈现出高度折叠的颗粒形状，由PHA(97.7%)、蛋白质(1.8%)和磷脂(0.5%)组成[10]。PHA颗粒由两层物质组成，内层是疏水性的聚酯核，外层是亲水亲脂的两亲层，两亲层为内层疏水性聚酯核在水性细胞质环境中提供增溶作用[11]。PHA颗粒的结构见图1。

图1 PHA颗粒的结构[11]Fig.1 Structure of PHA particles

2 有机废料合成PHA

总体来说，有三种方式可以合成PHA：酶催化、转基因植物合成和微生物发酵[12]。工业生产PHA主要是应用天然或者基因重组菌株进行生产，其优点是产品纯度高，提纯便利，但需要创建一个单一菌种环境，而这一过程造价昂贵且难以控制[1]。由此，混菌生产PHA工艺进入了研究者的视野。微生物生产PHA成本的50%来源于菌种的碳源[13]，碳源还影响细胞生长、细胞代谢的潜能以及聚合物的产量、产率、分子量、品质和组成[14]。碳源的选择被视为PHA商业规模生产的主要影响参数和瓶颈。

2.1 剩余污泥发酵液作为碳源

污水处理厂每天都会产生大量剩余活性污泥——作为污水净化的副产物，而剩余污泥中含有碳水化合物、蛋白质等有机物。如果能将剩余污泥资源化利用，不光可以降低污水厂处理成本，还能促进废物回收。剩余污泥发酵会产生大量挥发性脂肪酸(VFA)，这些VFA可以用作合成PHA的碳源。通常，剩余污泥应用于混菌三段式PHA生产工艺，见图2。除了VFA外，污泥发酵液中还有一部分非VFA物质——溶解性有机物(DOM，包括碳水化合物和蛋白质)和营养元素(包括氮和磷)。细菌对DOM摄取速度低于VFA，同时，过量的DOM会抑制产PHA细菌的富集和PHA的合成，但DOM也可以作为碳源合成PHA，且能够促进污泥的稳定[15]，因此发酵液中DOM需要达到一个平衡浓度。污泥发酵液中过量的氮、磷则会破坏PHA的生产条件，有研究发现[16]，当磷浓度从 127.60 mg/L 限制到 1.35 mg/L 时，胞内PHA质量含量从23%增加到51%，表明较低的磷浓度将促进PHA积累。高磷浓度有利于蛋白质合成，而降低磷浓度会导致蛋白质合成减少，从而增加PHA的产量。污泥与生活废物共发酵液比单独污泥发酵液产生更多的VFA，能够有效降低DOM比例，Valentino等[17]在中试规模上将城市固体废物与污泥共发酵(市政废物体积占比30%～35%，污泥体积占比70%～75%，42 ℃)，得到的发酵液VFA占SCOD为(75±9)%，SCOD/N/P为100/4.4/0.5。在分批试验中，混菌能够积累高达46%(质量分数)的PHA。污泥碱性发酵同样可以改善发酵液性能，Liu等[18]在pH 10条件下发酵污泥，得到的发酵液VFA占比达到(61.8±3.1)%，在添加少量氮磷情况下进行PHA积累试验，PHA含量达细胞干重60.3%，回收的多聚物中单体比例(按质量计)为98.3% HB和1.7% HV。此外，发酵液中VFA成分(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸)比例也会影响PHA的产率和单体组成，进而影响PHA的性能。一般认为，偶数碳VFA用来生产HB单体，而奇数碳VFA用来生产HV单体[19]。而HV单体的加入可以改善PHA性能，如降低熔点和提高延展性。HAO等[20]发现戊酸占VFA比例52.05%的发酵液可以用来生产HV和3-羟基-2-甲基戊酸盐(3H2MV)单体占比更高的PHA多聚物，且产PHA细菌富集反应器中，PHA最大含量为42.31%，HB、HV、3H2MV占比达到68.4，23.7，7.9 mmol C%。现在的研究大多在发酵液使用前除氮、磷，并在PHA合成达到最高时(碳充盈阶段结束)排放掉上清液以排除溶解性有机物的影响，但这不可避免地增加了工艺的成本与复杂性。未来的研究可着眼于调整发酵策略，如调整pH或投加药剂，降低发酵液中非VFA物质比例，改变VFA成分占比，并且有必要确定发酵液中非VFA物质水解机制。

图2 混菌三段式合成PHA工艺Fig.2 Mixed bacteria three-stage synthesis of PHA process

2.2 废弃油脂作为碳源

油脂相比其他传统碳源(如葡萄糖等)具有价格低廉和PHA产量高的优势[12]。中国社会每年产生废油脂超过1 000万t。当下，纯菌利用废弃植物油或废弃动物脂肪作为碳源合成PHA的研究较多。油在煎炸的过程中会经历许多化学反应，例如在较高温度下水解、热氧化和聚合，因此不需要任何预处理就可以用于PHA生产[21]。有研究表明[13]，将 0.1%(v/v)吐温80(Tween-80)表面活性剂添加到1%(v/v)废弃食用油(植物油)可提高菌株细胞干重，副球菌(Paracoccus) LL1菌株可在96 h内生产1.0 mg/L的PHBV共聚物，同时合成0.89 mg/L的类胡萝卜素副产品，缓解了PHA生产成本压力。但是，很多产PHA细菌无法直接摄取动物脂肪。对于这个问题，Romanelli等[22]将斯图兹里假单胞菌(Pseudomonasstutzeri) BT3菌株的lipC和lipH基因共表达到嗜酸菌(Delftiaacidovorans) DSM39菌株上，重组菌株可直接摄取动物屠宰场猪油脂合成PHA。合成的多聚物细胞干重占比达到43%。Riedel等[23]则在野生型Ralstoniaeutropha菌株基础上进行基因改造。原菌株在脂肪底物中产生每细胞干重79%～82%(w/w)的PHB，而重组细菌可以合成聚(羟基丁酸酯-羟基己酸酯)[P(HB-co-HHx)]，其产量达到每细胞干重的45%～72%，HHx含量达到16%～27%。这种共聚物比均聚物PHB性能优异，更适合于商业生产。

混菌利用废弃油脂可以应用三阶段工艺合成PHA。油脂用作碳源的优势在于不需要第一阶段的发酵单元，油脂可在第二阶段(产PHA菌富集)和第三阶段(PHA合成)水解。Ghosh等[24]研究表明，来自炼油厂的活性污泥有利用含油废水合成PHA的能力。实验发现，在碳充盈阶段微生物积累40%～70%的PHA，而在碳匮乏阶段PHA用于微生物的代谢，最终PHA的合成率在0.38～0.89 mg PHA/mg COD 之间。也有研究发现，与纯菌合成PHA类似，混菌不光可以利用油脂生产PHA，还可以同时生产增值产品，如三酰甘油(TAG)。Argiz等[25]利用罐头工业生产的残余油为碳源生产PHA和TAG。试验在序批式反应器(SBR)中进行产PHA菌的富集，在分批补料反应器(FBR)进行聚合物的合成。在分批补料应器中，将碳源和氮源分批供给，即只在碳匮乏阶段供给氮源，使PHA最大产量达到细胞干重82.3%。该研究证明了混菌也可以具有利用油脂合成PHA并同时生产另外一种增值产品的潜力。但油脂作为混菌碳源的弱势在于微生物摄取速率低，由此产PHA菌的富集时间被延长，Ghosh等[24]的好氧颗粒反应器(AGR)在42 d才开始稳定，而Argiz等[25]的SBR反应器在50 d才达到稳定状态，不利于工业化应用。油脂，尤其是具有饱和碳链的长链脂肪酸，作为碳源时的微生物摄取率不如其他底物，而且PHA产率较低。在今后的研究中可以向油脂中添加活性剂或者通过厌氧消化、酯交换法等预处理技术提高油脂的微生物利用率，进而提高PHA的产率。

2.3 柴油炼制废物(甘油)作为碳源

在全球范围内，大量粗甘油作为柴油产业的副产品被生产出来，粗甘油中含有62%～90%的甘油[26]。由于碳结构较少，甘油被认为是PHA合成的有效碳源。而且，甘油作为碳源合成PHA也可以弥补柴油生产过程的成本问题。有研究表明[27]，副球菌LL1菌株在添加2%甘油的矿物培养基中，96 h合成了3.77 g/L PHA，同时产生3.6 mg/L类胡萝卜素。而且，通过副球菌LL1的细胞保留培养，总细胞干重增加了2.2倍，最大细胞干重(24.2 g/L)下PHA含量达到39.3%(w/w)，并提高了总类胡萝卜素的产量。然而，在粗甘油中有许多其他的化学成分，包括生物柴油残渣、皂类、甲醇等[12]，这给直接生物合成PHA造成困难。而贪铜菌(Cupriavidusnecator)DSM545菌株可直接利用生物柴油中的粗甘油生产短链PHA的共聚物聚(3-羟基丁酸酯-4-羟基丁酸酯)[P(3HB-co-4HB)]。通过控制溶解氧和培养时间，可获得4HB摩尔分数在11.4%～21.5%之间的共聚物[28]。Gosh等[24]则利用从炼油厂分离出来微球菌(Micrococcusaloeverae)SG002菌株，用以柴油为基础的含油废水，在好氧颗粒反应器(AGR)中进行PHA的合成。经过21 d的培养，菌株达到 (81.40±0.2)% 的碳氢化合物去除率，PHA积累最大达到(0.47±0.01)mg PHA/mg CDW。对于粗甘油的利用，其最大阻力在于甲醇，它是细菌活动的抑制剂，可通过蒸发或相分离方法去除，但会增加成本；此外可考虑粗甘油与其他碳源共基质，以提高PHA产率。

2.4 木质纤维素及其衍生物作为碳源

木质纤维素是植物细胞壁的主要成分，许多种类的假单胞菌(Pseudomonas)都能摄取木质素[7]。假单胞菌可以分泌木质素降解酶(如漆酶和过氧化物酶)用于木质素解聚[29]。Unrean等[30]以碱性预处理甘蔗渣发酵液为碳源，对蒙氏假单胞菌(Pseudomonasmonteilii)生产PHA的工艺进行了优化。在最优投料条件下(碳氮比为0.18 g木质素∶1 mg NH4Cl)，实验获得238 mg/L的PHA聚合物，相当于细胞干重(DCW)13%。Wang等[31]在基因水平上对恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida) A514菌株进行改造。该菌株以木质素衍生物香草醛酸为碳源，PHA产量达到246 mg/L，为细胞干重34.5%(w/w)。同时，木质素衍生物还可以与其他碳源联用作为细菌底物，以达到优化PHA结构及产量的效果。Xu等[32]将木质素衍生物(苯甲酸盐、香草醛和香草醛酸)和甘油共进料，作为恶臭假单胞菌KT2440菌株的碳源。与单独投喂甘油相比，共基质下菌株细胞干重最大增加16.1%，PHA含量最大增加63.2%。而且，在甘油中添加木质素衍生物可使长链单体(C10和C12)的分布减少0.4%～4.4%，短链单体(C6和C8)的分布增加0.8%～3.5%。木质纤维素材料的紧密结构阻碍了碳水化合物的酶水解，因此，直接利用木质素前需要经过一系列预处理。木质纤维素常见的预处理方法包括蒸汽爆破处理、热处理、酸处理、碱处理、有机溶剂处理等[33]。Sawant等[34]利用里氏木霉和黑曲霉共培养制备的纤维素酶将玉米秸秆水解为粗糖。然后副球菌LL1菌株利用40 g/L的玉米秸秆发解液为碳源，PHA产量达到9.71 g/L。当前关于木质纤维素合成PHA的大部分研究都是利用其发酵液为碳源，而在此基础上开发能够降解木质素并产生PHA的微生物菌株，将是有效提高木质素转化率的可行性选择。

2.5 制糖业废料(糖蜜)作为碳源

糖蜜是制糖产业的主要副产物，是一种粘稠、黑褐色、呈半流动状态的物质。糖蜜作为生产PHA的碳源也得到了广泛的研究。Akaraonye等[35]用甘蔗糖蜜作为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus) SPV菌株的碳源生产PHB。在1 L摇瓶试验中获得的PHB达到细胞干重61.07%，在2 L发酵罐研究中获得的PHB 达到细胞干重的51.37%。而Cui等[36]通过使用合成糖蜜废水培养地中海富盐菌(Haloferaxmediterranei)，研究报告了温度对细菌合成PHA过程的影响。确定高温有利于提高地中海富盐菌的PHA产量。最近，研究者将糖蜜和其他碳源联用，达到合成PHA共聚物的效果。从枣树中获得的可再生资源——枣子籽油和枣子糖蜜可以用作贪铜菌的碳源，以生产P(3HB-co-3HHx) 共聚物。同时，通过改变供给细菌共基质的数量比例可以选择性地调节共聚物中3HHx和3HB单体的摩尔分数[37]。尽管糖蜜作为纯菌碳源时产量较高，但从黏稠底物中提取PHA仍然存在困难，针对不同的产PHA菌种，提出不同的提取方案仍是比较关键的。

糖蜜同样被应用于混菌合成PHA，研究内容集中在微生物群落的结构和生产力。有研究表明[38]，以糖蜜发酵液作为碳源，在PHA的合成阶段控制pH为8比不控制pH的生物量提高1倍，从而使PHA产率提高了1倍。Carvalho等[39]以糖蜜发酵液为底物，探究了微生物组成与PHA生产性能的关系。研究发现，摄取发酵糖蜜的产PHA菌群主要由固氮弓菌(Azoarcus)、陶厄氏菌(Thauera)和副球菌组成，前两种菌群的丰度最高。以固氮弓菌富集为主要组分，陶厄氏菌为次要组分的混合微生物可产生高HV含量的聚合物，这可能会改善PHA的机械性能。糖蜜发酵液浓度对混合菌群合成PHA也存在影响，研究表明[40]，在进水糖蜜发酵液浓度为 45 Cmmol VFA/L时，微生物显示出最佳PHA储存能力。在这种培养条件下产PHA菌生长旺盛，PHA含量最高可达细胞干重74.6%。为了更加有效地利用糖蜜，需要消除糖蜜中抑制微生物生长的污染物，如酚类和无机盐。糖蜜在发酵前使用各种膜滤技术有可能去除部分污染物，而这有待于更加深入的研究。

表1 各种有机废料作为碳源生产PHA实例Table 1 Examples of PHA production from organic wastes as a carbon source

3 PHA的提取工艺

在PHA积累阶段完成后，一般通过离心、过滤或沉淀将生物量从基质中分离出来，下一阶段需要从生物量中提取PHA。生物量中影响PHA纯度的杂质统称为非PHA细胞物，包括多肽、磷脂、DNA、RNA和肽聚糖等[1]。混菌比纯菌培养的细胞更耐水解，故从混菌细胞中提取PHA通常需要预处理，而在纯菌培养条件下无需任何预处理可以直接提取[41]。

PHA的提取有两种方式：第一种方式依赖溶剂打破细胞膜并溶解PHA颗粒，这一般是通过加入二氯甲烷或氯仿等物质实现[42]；第二种方式旨在消化和溶解细胞内的非PHA物质，使PHA成为不溶性固体。这种消化过程可以是生物的(例如酶)或化学的[43]。第二种方式的优点在于减少试剂投入量从而降低试剂成本。近些年，还有研究者用动物提取PHA，这种提取方式获取的PHA更接近自然形态。

3.1 从生物质中直接提取PHA

使用溶剂直接从生物质中萃取PHA在提取工艺中应用最为广泛，可回收高纯度PHA[44]。溶剂的作用是改变细胞膜的通透性，并使PHA溶解[1]。在大多数情况下，无论选取哪种萃取剂，在从富含PHA的生物质中提取PHA之前都需要对生物质进行冷冻干燥处理，因为生物质中水分的残留会降低提取效率。相比加热干燥，冻干不会导致聚酯链的断裂[45]，但冷冻干燥设备工艺复杂，在工业应用中会花费巨大的成本。

大量卤化溶剂，如氯仿和二氯甲烷，被广泛用于PHA的萃取过程。通过卤化溶剂萃取，可以高效地获得高纯度的多聚物，并且可忽略少量多聚物的降解。然而，这种萃取方式并不环保，尤其是氯化溶剂，对环境和工作人员会造成危害。此外，该过程需要大量的溶剂，溶剂加入量高达生物量的20倍[46]。针对卤化试剂的缺点，研究者将目光转向非卤化溶剂。研究表明[19]，碳酸二甲酯(DMC)可用作PHA提取的溶剂，1-丁醇用于PHA的沉淀纯化。试验发现每100 g生物量的PHA提取量为(30.7±1.6)g，PHA总纯度达到(98.0±0.1)%。通常，非卤化溶剂能够很好地溶解中等链长PHA。Bartels等[44]用丙酮对生物质中的P(HB-co-HHx)进行两阶段的萃取，并用2-丙醇进行纯化沉淀，最终从细胞中提取高达98%～99%的多聚物。非卤化溶剂的使用有助于降低PHA的生产成本，并形成一个更加生态化的过程，这都有助于PHA的商业化进程。

3.2 破坏细胞内非PHA物质间接提取PHA

PHA通常被细胞中非PHA物质包被，次氯酸钠、表面活性剂、酸碱化合物可用于溶解这些非PHA物质。另外，这些试剂均可以在水中使用，与溶剂萃取相比，不需要干燥生物质，可极大地降低成本[1]。Colombo等[47]使用非离子表面活性剂吐温-20(Tween-20)对生物质进行预处理，然后使用碳酸二甲酯提取PHA，PHA提取效率可达50%，与使用氯仿获得的提取效率(63%)非常接近。此外，将两种预处理试剂联用也可以达到不错的效果。Mannina等[41]先用次氯酸钠处理生物质，然后用月桂酸铵消化细胞内非PHA物质(月桂酸铵与生物量质量比为2∶1)，接触反应3 h，获得PHA回收率和纯度分别为(74±8)%和(100±5)%。一般来说，化学消化最大的缺点在于PHA降解，且化学消化过程会产生大量废水。因此，有研究[42]提出用稀氨水消化细胞内非PHA物质，结果证明稀氨水在75～115 ℃ 的温度下对生物质进行处理，可获得近90%的PHA回收率和90%以上的纯度。该研究为提取工艺优化提供了一个有价值的方向。

蛋白酶、磷脂酶、溶菌酶和核酸酶等酶可水解细胞内非PHA细胞物[1]，且由于酶对催化反应的高度特异性，不会导致PHA大量降解。Lakshman等[48]使用来自小双孢菌属(Microbispor)的裂解酶对含有50% PHA的草木犀中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)进行酶消化，实现了94%的PHA回收率和92%的PHA纯度。虽然酶消化是一种环境友好的方法，但是因为其工艺的复杂性，在工业还难以应用。

此外，有研究者发现可利用生物体回收PHA。有些动物的消化系统能够摄取细菌细胞，但不能同化PHA颗粒，最后将其以粪便的形式排出，从而导致PHA回收和纯化。通过这种生物回收方法回收的PHA接近其在细胞中的固有形态，即以颗粒形式存在。Murugan等[49]发现粉虱可以吃掉冷冻干燥的贪铜菌细胞，然后以白色粪便的形式排出PHA颗粒。经过洗涤、加热进一步纯化后，PHA颗粒纯度几乎达到100%。可能其他昆虫在PHA颗粒回收方面更加有效，而这需要进一步的探索，使用生物的方法回收PHA可以最大限度减少化学试剂的使用。