校园水体夏季细菌内毒素水平调查及吸入暴露风险评价

贾 芮，赵金辉,*，董路遥，嵇译峰，王守荣，王丽娟

(1.南京工业大学城市建设学院，江苏南京 211816；2.光大水务<南京>有限公司，江苏南京 211800)

细菌内毒素作为一种热源物质，可随呼吸等途径进入人体，从而引起机体产生如发热、哮喘、低血压、昏厥甚至死亡等不良反应[1-2]。高校校园尤其是南方校园，常存在一定的天然水体以及喷泉等景观水体，水体中细菌内毒素主要是革兰氏阴性菌和部分蓝藻的脂多糖复合物，在水体中普遍存在，因而导致水体中存在一定内毒素风险[3]。目前，对自来水厂水体中和养殖场大气中内毒素水平研究较多，仅有部分学者对校园环境中如餐厅、教室等场所大气中内毒素水平进行报道，但对校园水体特别是景观水体中的内毒素水平及其潜在吸入暴露风险研究较少。

水体中的内毒素一般不会经口摄入以及与皮肤接触，因此，胃肠暴露和皮肤暴露风险低[4]，呼吸吸入成为主要暴露方式和风险途径。Humudat等[5]研究表明夏季水体中内毒素水平最高，温暖家[2]研究发现1 d中早中晚内毒素水平波动较小；Mcgregor等[6]研究发现空气中内毒素水平与水体内毒素水平呈正相关性。因此，本文通过在内毒素水平最高的夏季对校园水体及周边空气中细菌内毒素水平进行调查，并结合问卷调查及国内外相关报道，采用剂量-反应关系模型结合中国环境科学研究院发布的暴露参数，进一步对其潜在吸入暴露风险进行了评价。

1 试验方法及材料

1.1 检测方法

目前，细菌内毒素的检测方法主要有家兔法、鲎试剂法、气相色谱-质谱检测法、凝胶过滤色谱-质谱检测法、重组C因子法、酶联免疫测定法、生物传感器法及电路波段法等[1]。本试验采取国内外常用的鲎试剂法对内毒素水平进行测定，通过终点显色法来定量测定内毒素水平，并以凝胶法进行辅助验证。

终点显色法的检测机理是依托鲎试剂的凝固系统可被微量内毒素激活，激活后的鲎试剂与鲎三肽作用形成淡黄色物质对硝基苯胺(PNA)，在N-1-萘乙二胺盐酸盐的作用下，形成玫红色偶氮物质，在545 nm波长下测出吸光度，可反映内毒素水平。

其他水质指标按《水和废水监测分析方法》(第四版)相关方法测定。

1.2 试剂配置及材料处理

鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司，批号2008122，每支0.5 mL，灵敏度为0.125 EU/mL)加入细菌内毒素检查用水(湛江安度斯生物有限公司，批号2010220，5 mL/支，≤0.000 5 EU/mL，简称BET，下同)500 μL漩涡混合15 min；鲎三肽(南京肽业生物科技有限公司，2 mg/管，98.26%)加入2 000 μL的BET漩涡混合15 min，配成1 mg/mL的鲎三肽溶液；称取亚硝酸钠0.040 0 g，加入1 mol/L盐酸溶液100 mL配成0.04%亚硝酸钠溶液；称取氨基磺酸胺0.300 0 g，加BET 100 mL配成0.30%氨基磺酸胺溶液；称取N-1-萘乙二胺盐酸盐0.070 0 g，加BET 100 mL配成0.07% N-1-萘乙二胺盐酸盐溶液[7]。内毒素标准品(湛江安度斯生物有限公司，批号2007101，10 EU/支)配置成5.0、1.5、1.0、0.75、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 3 EU/mL,每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30 s。

所用玻璃器皿均无热原化处理，采用铬酸洗液浸泡24 h，自来水冲洗5次，蒸馏水冲洗4～5次，马弗炉250 ℃烘烤2 h。非耐热器皿过氧化氢浸泡2 h，蒸馏水冲洗4～5次，烘箱60 ℃烘烤1 h。

1.3 水体资料及样本采集

样本分别来自校园3个行人量较大的湖泊A、B、C。湖A是一片面积约为10 000 m2的三角形水域(32°08′48.05″N，118°63′20.02″E)，3边均设有道路，最深处水深约为10 m，为一人工拦蓄水库，湖内设有喷泉，重大节日在每天18：00—21：00喷泉灯光表演，其他时间喷泉关闭。湖B是一片面积约为12 000 m2的不规则水域(32°08′23.14″N，118°63′47.25″E)，其中一侧设有广场，水深较浅，为一景观水域。湖C是一片面积约为2 500 m2的水滴型水域(32°08′62.59″N，118°63′50.78″E)，一侧设有道路，为一山坳处的天然水体，水深约为4 m，雨后水位显著上涨。

大气内毒素采样时间为16：00—19：00，气温为23～27 ℃，微风。水样采集通过岸边多点采集方式，采样点距离湖边50 cm、采样深度为水面下30 cm，所采集水样用0.45 μm滤膜过滤预处理，共获取3组共18个水样，测定水质指标结果如表1所示。大气内毒素利用大气采样仪采集(TQ-1000)。根据报道，我国19岁青年人鼻子平均高度为155 cm，故采样口高度为155 cm，采样于同一地点、近湖路侧1 m处。采样器为10 mL的U型多孔玻板吸收器，采样液为8 mL的内毒素检查用水，设置进气流量为1.5 L/min采样20 min，气样无需特殊处理[2]，共获取4组24个气样。

表1 水体水质样本监测Tab.1 Water Quality Monitoring of Water Body Samples

1.4 水体内毒素测定标准曲线的建立

根据相关研究[7-8]报道的方法进行测定，得出9个标准内毒素溶液(Ab)、空白对照(Ak)的吸光度，对于吸光度大于1的溶液应稀释后再测量。绘制浓度-吸光度标准曲线并进行线性回归，结果如式(1)。

A=0.0679 9+0.643 6Cr=0.987 5

(1)

其中：A——吸光度；

例8：研究发现，我国英语学习者具备了一定的语法隐喻使用意识，但对概念语法隐喻使用匮乏，不利于体现学术语篇的抽象性与客观性;

C——内毒素含量，EU/mL。

结果表明，内毒素含量为0.125～1.500 EU/mL线性关系良好，故本批次试剂内毒素检测含量为0.125～1.500 EU/mL。

2 结果与评价

2.1 水体及大气内毒素调查结果分析

通过终点显色法测定不同稀释倍数的样品内毒素含量，通过凝胶法对检测限内的样品进行验证，均形成坚实凝胶，数据有效，如表2、图1所示。湖水A、B、C样本稀释倍数分别为100、100、200倍，其余为0；各样本数均为6，采用凝胶法验证时，各样本均呈阳性。

表2 校园水体及大气中内毒素水平调查Tab.2 Survey of Endotoxin Levels of Water and Atmosphere on Campus

图1 内毒素水平箱线图Fig.1 Box Plot of Endotoxin Level

通过对3组54个检测结果分析发现水质条件越差水中内毒素水平越高。水中内毒素水平与水样氨氮、CODCr、UV254的相关系数r分别为0.43、0.63、0.98，如图2所示，表明天然水体中内毒素水平与UV254相关性较大。UV254可体现水体中腐殖质的含量。腐殖质是有机物经微生物分解转化形成的胶体物质，其值高表明微生物活跃。结合张灿等[9]的报道，UV254与结合态内毒素相关性大，游离态内毒素相关性小，这与腐殖质胶体类物质特点有关。分析发现湖水C的内毒素水平较高的原因主要有2个：一是相较于湖水A、B，湖水C周边落叶树木较多，落叶沉入水底形成腐殖质，增强了微生物的活跃程度；二是监测到湖水C有一处入湖排口间歇少量排水，对排口水质检测发现CODCr质量浓度为56.14 mg/L，内毒素水平为湖水C的2.32倍。在自身微生物活跃、外来营养条件好及外来内毒素水平高的多个因素下，导致湖水C的内毒素水平比湖水A、B高。

图2 内毒素水平与水质指标的相关性Fig.2 Correlation between Endotoxin Levels and Water Quality Indices

为进一步评价校园水体内毒素水平，对一生活污水厂进行取样调查，污水厂进水内毒素水平为(8 262.97±1 479.23)EU/mL，紫外消毒后尾水内毒素水平为(1 070.98±173.09)EU/mL。将校园水体内毒素水平结果与张灿对北京水库、武汉长江及汉江内毒素水平的调查结果进行对比发现，湖水C的内毒素水平均值是其最高值的2.15倍，但明显低于如蓝藻暴发期、排污水等水体[10]。因此，校园内3个水体的内毒素水平均低于污水厂进水和尾水，湖水A、B内毒素水平与天然水体相似，湖水C内毒素水平高于天然水体。

对获取的18组水、气内毒素水平数据分析发现，水体周边大气内毒素水平与水体内毒素水平的相关性系数r为0.94，成正比例关系。湖水C的内毒素水平为(217.32±13.82)EU/mL，导致湖水C周边大气内毒素水平高于湖水A、B。对比湖水A喷泉开启前后发现，开启后水体周边大气中内毒素水平是开启前的2.55～4.81倍。在原水内毒素水平仅有37.45～46.15 EU/mL的情况下，喷洒条件下仍可使大气内毒素水平达到173.61～233.28 EU/m3，明显提高了大气内毒素水平。

2.2 校园水体内毒素吸入暴露风险评价

结合温暖家[2]的报道，采用剂量——反应关系模型。根据本文研究对象的特点，判定内毒素是非致癌物，呼吸系统吸入日平均暴露量计算公式、非致癌总风险健康风险评估为式(2)～式(4)。

(2)

(3)

HI=∑HQi

(4)

其中：ADD——平均暴露量，EU/(d·kg)；

c——大气内毒素水平，EU/m3；

IR——呼吸速率，m3/d；

EF——暴露频率，d/a；

ET——暴露年限，a；

BW——人体质量，kg；

AT——预期寿命，d；

HQ——非致癌风险商；

RfD——参考剂量，EU/m3，本文取90 EU/m3；

HI——风险指数。

根据《中国人群暴露参数手册(成人卷)》[14]，男性IR、ET、BW、AT值分别为19.02、24、62.7、25 404；女性IR、ET、BW、AT值分别为14.17、24、54.4、26 754.5。各个场所的人流密度、人群活动强度等特点各有不同，学生一年在校约为270 d，调查学校学生上课等日常活动均会经过3个湖区，喷泉仅在如国庆、开学季、毕业季等时期开启，因此，4处的EF值分别为270、30、270、270。计算结果如表3所示。

表3 吸入暴露风险评估结果Tab.3 Assessment Results of Inhalation Exposure Risk

结果表明，正常状况下3个水体中，湖水C的暴露剂量最大，这与内毒素水平成正相关关系；喷泉A暴露剂量最小是因为暴露频率最低，仅为30 d/a。根据Mcgregor等[6]的报告，类似场景中如游泳馆水雾喷洒和水幕曾引发群体性过敏性肺炎，因此，对暴露频率较高、内毒素水平较高的喷洒场景仍有风险。

男性平均暴露量与非致癌风险商均高于女性。分析发现女性呼吸速率慢、体重轻、寿命长，从而导致平均暴露量低于男性，在相同参考剂量下女性内毒素吸入的非致癌风险低于男性。

根据吸入暴露风险评价结果，HQ及HI均小于1，表明风险较小或可忽略，本次调查4处场景均小于1，表明风险较小。结合温暖家[2]对于校园内8个公共场合内毒素吸入风险的报道，8场所HI累计值为0.908，接近于1，当HQ>1或HI>1时，认为此条件下的内毒素对暴露人群存在非致癌风险。本次仅针对校园内部分水体，南方校园水体众多，因此，多场所风险叠加或可导致内毒素吸入的非致癌风险。

2.3 校园水体内毒素吸入效应调查

为进一步考察校园水体内毒素对暴露人群风险效果，以调查问卷的形式，对经过水体的学生进行调查并对调查统计分析。调查共获得60份有效样本，其中男性样本为40个，女性样本为20个，年龄为19～27岁。多数调查对象反映主要为湖边经过，停留0～5 min为50人、5～10 min为8人、10～15 min为1人，逗留休闲15 min以上1人(35 min)，均表示经过湖区及之后无内毒素不良反应，如呼吸不畅、咳嗽、发热等。根据荷兰提出的8 h暴露时间下吸入总量为1 157 EU，调查人群一次暴露总量最高为84 EU，远低于风险值，因此，内毒素吸入风险还与一次暴露时间有关。

因此，正常步行经过3个水体不会引起内毒素吸入风险，但应避免长时间停留及高频率暴露。

3 结语

通过对校园3个行人量较大的湖泊水体和周边大气内毒素调查表明。

(1)大气内毒素水平与水体内毒素水平成正比例关系，同时校园内存在大气内毒素水平高于阈值区域。

(2)喷洒条件下可导致大气内毒素水平提高2.55～4.81倍，因此，在避免长时间、高频率、近距离接触此类喷洒场景的同时应对此类水体进行安全防护。

(3)进一步对水体周边大气内毒素吸入风险评价，表明校园水体内毒素非致癌风险较小，正常经过不会造成吸入风险，但应避免多场所风险累积，以免导致内毒素吸入过量的风险。