基于Box-Behnken-Matlab分析法优化高亚油酸含量南瓜籽油提取工艺研究

薛 山，黄艺婷，李冬冬

(闽南师范大学生物科学与技术学院1，漳州 363000) (菌物产业福建省高校工程研究中心；闽南师范大学2，漳州 363000)

南瓜籽是南瓜加工的副产品，其油脂质量约占籽粒干重的35%～64%[1]。南瓜籽油是一种具有生物学活性的高品质食用油脂，富含多不饱和脂肪酸(PUFA)，其中以亚油酸(LA)组分最具代表[2,3]。研究显示，LA能够有效抑制良性前列腺增生，预防、缓解和治疗男性泌尿生殖系统疾病[4]。同时，南瓜籽粗油提取物中含有类胡萝卜素、植物甾醇、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚等高活性油脂伴随物，其中总酚含量为167.21～204.50 mg/kg，不同产地、品种南瓜油功能性成分有所差异[5-7]。南瓜油因具有抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、降三高、改善尿道疾病[8,9]、恢复运动员糖代谢能力[10]等保健功效，广泛应用于食品、医药和精细化工领域。

南瓜籽油的提取工艺有物理压榨法、有机溶剂浸提法、水酶法、超声波辅助提取法[8,11]、亚临界/超临界流体萃取法[12]、水剂法[13]等。在其中，溶剂浸出法易于工业化生产，对工厂设备要求不高，也是目前广泛使用的一种方法[3]。针对南瓜籽油提取工艺的优化多以油脂浸提率为指标，以油脂功效成分含量为指标的工艺优化鲜见报道。因此，LA作为南瓜籽油中的主要PUFA组分及功效活性成分，以其为评量指标的优化研究具有重要应用价值。

本研究以新疆裸仁南瓜籽作为对象，通过考察单因素对低温烘焙处理后南瓜籽油LA相对含量的影响，进而基于南瓜籽粗油LA相对含量和粗油得率双重评量指标开展Box-Benhnken-Matlab工艺优化试验，为高比例LA南瓜籽油工业化开发生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

裸仁南瓜籽(油脂含量为45.70 g/100 g)，产自新疆维吾尔自治区乌鲁木齐。苯、石油醚(沸程30～60 ℃)、没食子酸、碳酸钠、福林酚试剂(分析纯)、正已烷(色谱纯)、三氟化硼甲醇溶液、37种脂肪酸甲酯混标(标准品)。

1.2 实验仪器

DGG-9140B电热恒温鼓风干燥箱，VCX800超声波破碎仪，AR124CN电子天平，DZF-6034A真空烤箱，HH-2数显恒温水浴锅，XW-80A漩涡混合器，7890B气相色谱仪。

1.3 测定方法

1.3.1 南瓜籽油的提取

南瓜籽的筛选：剔除破损或开裂的南瓜籽籽粒，30 ℃鼓风干燥48 h，确保南瓜籽含水量≤4%，用塑料袋密封后于4 ℃阴凉处保存备用[14]。南瓜籽油的提取参照Moo-Huchin等[15]方法略微修改。称量约10.0 g南瓜籽，进行低温锡箔烘烤处理(将南瓜籽样品用锡箔纸包裹，放入真空烤箱125 ℃ 烘烤15 min，真空度达133 Pa)，待冷却至室温粉碎，按料液比1∶12 g/mL加入石油醚，320 W超声一段时间后，于45 ℃索式萃取3.5 h，将提取后的混合液于45 ℃真空挥干溶剂，即得南瓜籽粗油。南瓜籽粗油得率以南瓜籽油质量与南瓜籽初始质量的比值进行计算。

1.3.2 南瓜籽油的LA分析

向南瓜籽粗油中加入3 mL苯-石油醚(1∶1)，将含有南瓜籽粗油的混合溶液转移至10 mL具塞试管中，加入2 mL三氟化硼甲醇试剂，涡旋混匀振荡后于50 ℃恒温水浴锅中加热2 h，放置4 ℃冰箱过夜，使油脂充分甲酯化。气相色谱上样检测前将混合体系加入1 mL正己烷(色谱纯)，充分振荡后再使之静置分层，取1 mL上清液，过有机相滤膜(0.45 μm)后装气相瓶备用。

脂肪酸甲酯的测定采用7890B气相色谱仪，使用 FID 检测器和强极性二氰丙基-聚硅氧烷-非键合气相色谱柱(SH-RtTM-2560,100 m×0.25 mm×0.20 μm)。程序参数为：分流比 10∶1，进样量1 μL，载气为氮气，流速1.5 mL/min，进样口和检测器的温度均设置250 ℃。柱箱的升温程序为：起始温度为140 ℃，保持1 min，以 4 ℃/min 升到240 ℃并保持5 min。脂肪酸的定性分析：比对样品脂肪酸甲酯与37种混合脂肪酸甲酯标准品的保留时间；脂肪酸的定量：采用面积归一化法进行分析[16]。包括LA在内的脂肪酸相对含量用单个脂肪酸峰面积占总脂肪酸峰面积加和的比例(%)表示。

1.3.3 单因素实验1.3.3.1 超声时间

考察超声时间5、10、15、20、25 min对南瓜籽油LA相对含量的影响。其他条件为：低温锡箔烘烤处理125 ℃ 15 min，超声功率320 W，料液比1∶35，提取温度35 ℃，提取时间3.5 h。

1.3.3.2 料液比

考察料液比分别为1∶15, 1∶25, 1∶35, 1∶45, 1∶55对南瓜籽油LA相对含量的影响。其他条件为：超声时间15 min，提取温度35 ℃，提取时间3.5 h。

1.3.3.3 提取温度

考察提取温度分别为25, 30, 35, 40, 45 ℃对南瓜籽油LA相对含量的影响。其他条件为：超声时间15 min，料液比1∶35，提取时间3.5 h。

1.3.3.4 提取时间

考察提取时间分别为1.5, 2.5, 3.5, 4.5, 5.5 h对南瓜籽油LA相对含量的影响。其他条件为：超声时间15 min，料液比1∶35，提取温度25 ℃。

1.3.4 双响应面实验

基于单因素实验结果，按照Box-Behnken响应面分析法的因素与水平表(表1)，以LA相对含量(Y1)和粗油得率(Y2)为双响应值，进行提取工艺条件优化。

表1 响应面分析法的因素与水平表

1.3.5 最优组合验证实验

依据Box-Behnken双响应面实验得到的最优工艺参数结果，进行验证。

1.3.6 Matlab优化实验

基于单因素实验结果，利用Matlab软件程序运算，量化料液比(A)，提取温度(B)，提取时间(C)对南瓜籽LA相对含量(Y1)和粗油得率(Y2)的三维及四维交互影响。

1.3.7 总酚含量测定

总酚的提取和测定参考魏征等[17]方法。称取1.000 0 g 南瓜籽粗油于50 mL离心管中，按料液比1∶1、1∶20加入正己烷和甲醇，分别漩涡30 s，置于超声波清洗器中，在30 ℃、270 W、45 kHz 下超声提取 30 min，7 600 g 离心 10 min，分离有机相，残油重复提取2 次。合并3次有机相，40 ℃下真空旋蒸，2 mL甲醇复溶。

取20 μL样液或各梯度标准液至 2 mL 离心管，依次加入780 μL蒸馏水、50 mL福林酚试剂和150 μL 20%的Na2CO3溶液。漩涡 30 s，40 ℃水浴 30 min，使用酶标仪在 760 nm 波长处测定吸光度。结果以没食子酸当量表示(mg GAE/kg)，标准曲线y=0.001 2x+0.000 7(R2=0.999 8)，线性范围 0～500 μg/mL。

1.3.8 数据处理方法

实验结果用3次重复的平均值±标准差表示。采用SPSS Statistics 24.0软件对数据结果进行显著性分析，P<0.05表示结果显著，标示为不同字母。利用Design-Expert 8.0.6 Trial软件进行响应面优化试验。

2 结果与分析

2.1 GC分析南瓜籽油LA相对含量

南瓜籽油中含有多种人体所需脂肪酸，尤其是LA组分，南瓜籽油的提取利用能够大大提升南瓜籽的附加值[18]。低温烘焙作为一种相对健康、环保的烹饪加工方式在坚果、粮食谷物预处理方面已广泛应用[19]。在前期成果的基础上，为降低传统烘焙处理对南瓜籽油PUFA的破坏，对南瓜籽进行低温锡箔烘焙预处理，在超声功率320 W，超声时间15 min，石油醚料液比1∶35 g/mL，提取温度35 ℃，提取时间3.5 h条件下经GC分析鉴定出4种脂肪酸(图1)：棕榈酸(C16∶0)(14.92±0.21)%、硬脂酸(C18∶0)(6.72±0.10)%，油酸(C18∶1,cis-9)(31.10±0.37)%和LA (C18∶2,cis-9,12)(47.24±0.20)%，其中LA相对含量比Cuco等[12]加压CO2法提取的还要高，且显著高于南瓜籽油脂中其他种类脂肪酸[20,21]。

图1 南瓜籽油脂肪酸甲酯气相色谱图

2.2 单因素实验结果

2.2.1 超声时间对南瓜籽油LA相对含量的影响

从图2可知，随着超声时间的延长，南瓜籽油LA相对含量有所升高，其中超声时间10～25 min区间差异并不显著(P>0.05)，综合考虑LA相对含量升高幅度及能耗情况，选择超声时间15 min进行后续试验。胡代花[22]采用超声辅助溶剂法提取了大鲵肝脏油脂，适当的超声前处理能够提升粗油得率，且不破坏油脂中的PUFA组分。

图2 超声时间、料液比、提取温度和提取时间对南瓜籽油LA相对含量的影响

2.2.2 料液比对南瓜籽油LA相对含量的影响

由图2可知，在料液比1∶15～1∶55内，南瓜籽粗油得率会随着料液比增大呈现先显著升高(P<0.05)后显著下降(P>0.05)的趋势变化。当料液比达到1∶35时，LA相对含量有最大值，故选择此参数值。这可能是因为料液比适当的增加能够提升油脂的得率，尤其是更有效地提取油脂中的LA组分。

2.2.3 提取温度对南瓜籽油LA相对含量的影响

由图2可知，南瓜籽粗油中LA相对含量会随着提取温度的升高，先略微增大(P>0.05)，后显著降低(P<0.05)，在30 ℃时达到最大值。产生该现象的原因可能是温度适当升高有利于LA组分的提取，但是温度过高也会造成LA提取率下降或氧化[23]。因此，选择提取温度为30 ℃。

2.2.4 提取时间对南瓜籽油LA相对含量的影响

由图2可知，在提取时长为1.5～5.5 h范围内，LA相对含量先显著升高后下降(P<0.05)，当提取时间2.5 h时LA相对含量达到最大。这可能是由于提取时间过长容易引起LA组分氧化所致。因此，选择提取时间2.5 h。

2.3 Box-Behnken-Matlab实验结果分析

2.3.1 Box-Behnken双响应面优化实验结果

基于单因素实验结果，采用Box-Behnken进行三因素(料液比(A)、提取温度(B)、提取时间(C))三水平(-1，0，1)的实验设计。LA相对质量分数(Y1)和粗油得率(Y2)的双响应面实验设计与结果见表2，基于Y1和Y2的方差分析结果分别见表3和表4。

表2 Box-Behnken实验设计与结果

表3 基于Y1的方差分析结果

表4 基于Y2的方差分析结果

经多元回归拟合，得到南瓜籽油LA相对含量(Y1)和粗油得率(Y2)对自变量料液比(A)、提取温度(B)、提取时间(C)的二次多项回归方程分别为：

Y1=47.66-0.59A-0.4B+0.5C-0.18AB-0.05AC+0.23BC+0.13A2-0.39B2-0.51C2

(1)

Y2=25.14+0.89A-0.21B+0.32C+0.30AB+0.65AC-0.09BC-1.82A2-1.45B2-1.25C2

(2)

基于Y1和Y2优化的二次模型的方差分析结果如表3和表4所示，Y1和Y22个模型均极显著(P<0.01)，失拟项不显著(P>0.05)，模型拟合性良好。Y1的回归方程相关系数R2=0. 944 4，说明响应值的变化有94.44%来源于所选3个变量。同理，Y2的回归方程相关系数R2=0.977 9，说明响应值的变化有97.79%来源于所选3个变量。通过F值分析可知，各因素对Y1和Y2影响的显著性大小均为：料液比(A)>提取时间(C)>提取温度(B)。2个模型的变异系数分别为0.56和1.60，均在可接受范围内，说明该模型的重复性良好。

2.3.2 Box-Behnken双响应面相互作用

经Box-Behnken双响应面作图分析，料液比(A)、提取温度(B)和提取时间(C)3个因素的两两交互作用对南瓜籽油LA相对含量(Y1)的影响均不显著(P>0.05)，其中BC>AB>AC；料液比与提取时间(AC)的交互作用对粗油得率(Y2)的影响较大，响应曲面的坡度也较陡，而AB和BC对试验结果交互作用不显著(P>0.05)，3个因素两两交互作用显著程度为AC>AB>BC，与表3和表4的分析结果一致。

2.3.3 Matlab分析结果

Matlab科学计算功能强大，能够通过程序代码编写建立数学模型有效计算出最优解[24,25]。目前，Matlab已广泛应用于工艺优化，在食品领域的报道有食用油脂提取工艺优化[3]、葡萄籽多酚提取工艺优化[26]、菠萝皮渣多酚提取工艺优化[27]等。

通过建模得到料液比(A)、提取温度(B)和提取时间(C)对Y1和Y2影响的四维效果图(图3，图4)。当Y1取得理论最大值(48.552 1%)时，通过矩阵计算得到A为1∶40 g/mL，B为27.14 ℃，C为2.76 h；同理，当Y2取得理论最大值(25.302 6%)时，A为1∶36.33 g/mL，B为24.69 ℃，C为2.59 h。

图3 基于Y1优化的四维交互曲面

图4 基于Y2优化的四维交互曲面

为了更细致地描述分析各因素间的交互作用，分别绘制当C取下限值(2 h)，中间值(2.5 h)，上限值(3 h)时，A与B对Y1，Y2交互影响的三维旋转曲面与等高线投影图(图5)。

当C取下限值(2 h)时，固定B，随着A的升高，Y1(实线)逐渐增高；固定A值，随着B的升高，Y1先升高后降低。固定B值，Y2(虚线)呈现先升高后降低的趋势，固定A值，Y2在提取温度为20～30 ℃范围内先升高后降低，在25 ℃处取得最大值。此时，Y1为45.409 4%～47.427 8%，Y2为19.640 5%～23.581 4%。当A为1∶33～1∶38，B为22～28 ℃时，Y1和Y2可同时取得最大值。

a C取下限值(2 h)

b C取中间值(2.5 h)

当C取中间值(2.5 h)时，Y1和Y2的变化趋势与C=2 h时一致。此时，Y1为46.241 4%～48.416 1%，Y2为20.477 5%～25.254 5%。当A为1∶34～1∶38，B为22～27 ℃时，Y1和Y2可同时取得最大值。

当C取上限值(3 h)时，Y1和Y2的变化趋势与C=2 h和2.5 h时一致。此时，Y1为46.051 3%～48.448 4%，Y2为18.810 5%～24.539 2%。当A为1∶34～1∶40，B为21～27 ℃时，Y1和Y2可同时取得最大值。

因此，当C取上线值(3 h)时，Y1能够取得最大理论值，当C取中间值(2.5 h)时，Y2能够取得最大理论值。当C为2.5～3 h，A为1∶34～1∶39，B为22～27 ℃时，Y1和Y2均能够取得理论较大值。

2.3.4 Box-Behnken-Matlab最佳工艺预测及验证实验

通过t软件分析，得到最佳提取工艺参数的理论值为料液比(A)取1∶38.65，提取温度(B)取25.75 ℃，提取时间(C)取2.695 h，南瓜籽粗油LA相对质量分数(Y1)为48.31%，粗油得率(Y2)为24.91%。经验证，Y1实际值为(48.23±0.11)%，Y2实际值为(24.83±0.12)%，与理论值差异不显著(P>0.05)，方法可行。此研究得到的南瓜籽粗油LA相对含量，显著高于孙立斌等[28]以酶解冷榨法制取的南瓜籽粗油LA相对含量(38.02%)；由南瓜籽粗油含量(45.70 g/100 g)及得率(20.53%～25.56%)换算，本研究所得南瓜籽出油率为44.92%～55.93%，低于孙立斌等[28]研究结果(出油率为72.6%)。

2.4 南瓜籽粗油中总酚含量

经测定，最优条件下提取南瓜籽粗油中总酚含量为(968.71±13.96) mg GAE/kg，高于王璐等[29]研究结果(672.2～952.8)mg GAE/kg。植物油脂的保健功效与其油脂伴随物中含有的天然抗氧化成分多酚密不可分[30]，且多酚的种类、含量和性质，受原料来源、预处理、加工工艺，提取和测定方法等多种因素的共同影响[31,32]。南瓜籽粗油特征多酚种类、含量、生物活性及其在加工过程中的变化有待后续深入探究。

3 结论

本研究采用低温锡箔烘焙处理裸仁南瓜籽，并以LA相对含量(Y1)与粗油得率(Y2)为双指标的Box-Behnken-Matlab分析法对后的南瓜籽粗油进行超声波辅助溶剂提取法工艺优化，得到最优提取工艺参数为：超声时间15 min，料液比1∶38.65，提取温度25.75 ℃，提取时间2.7 h，此时，Y1为(48.23±0.11)%，Y2为(24.83±0.12)%；当提取时间的范围为2.5～3 h，料液比1∶34 ～1∶39，提取温度22～27 ℃时，在此工艺参数区间Y1和Y2可同时取得较大理论值，此时粗油中总酚含量为(968.71±13.96)mg GAE/kg。Box-Behnken-Matlab分析法不仅能够得到高LA相对含量南瓜籽油的最优具体工艺参数，也可以在兼顾LA相对含量和粗油得率的情况得到较优工艺参数范围。