球形芽孢杆菌转化猪去氧胆酸为3β-猪去氧胆酸的研究

盛 敏，谢小国，李国军，邓家国，欧阳文凯，万里平，李跃忠

（常德云港生物科技有限公司，湖南 常德 415001）

1 背景介绍

甾体化合物（steroids）也称类固醇，是一类以环戊烷多氢菲为母核的化合物，侧链上有不同的基团。环戊烷多氢菲母核包含3个六元环（A、B、C）和1个五元环（D），结构式如图1所示[1]。几乎所有甾体化合物母核的第C10和C13位都含有角甲基、伯醇或醛基等，C3、C11、C17位可能连接羟基或酮基，A环和B环在不同位置上含有多个双键，C17位上连接结构不同的侧链等[2]。当甾体母核上的取代基团和双键位置不同时，甾体的生理活性差异明显，据此形成了一系列生理功能各异的甾体化合物。猪去氧胆酸（3α,6α-二羟基胆烷酸，HDCA）是由3个六元环、1个五元环组成的甾体骨架和1个脂肪侧链共24个碳原子构成的甾体化合物，结构式如图2所示[3]。

图1 环戊烷多氢菲核

图2 猪去氧胆酸结构式

HDCA经由猪胆汁提取、加工制成，具有降血脂、祛痰、镇咳的作用。HDCA对百日咳杆菌、白喉杆菌、金黄色葡萄球菌等有一定的抑制作用，可用作消炎药，治疗慢性支气管炎、小儿病毒性上呼吸道炎症等。HDCA还是人工牛黄配方的重要原料，也是清开灵等其他中药制剂的成分[4]。3β-猪去氧胆酸（3β,6α-二羟基胆烷酸，3β-HDCA）是HDCA的同分异构体，在猪胆汁中天然存在，能在HDCA的合成、提取中作为杂质影响HDCA的纯度。目前，市面上有3β-HDCA出售，可作为标准品使用。3β-HDCA主要通过化学法合成，由于化学方法存在污染环境、合成工艺复杂等不足，研究人员致力于寻找更加快捷简便、稳定高效并且对环境友好的甾体化合物（如3β-HDCA）的生产方式，如生物转化法。

生物转化是利用生物体系（包括植物、微生物或动物组织的培养体系）或生物体系相关酶制剂对外源有机底物某一特定部位或功能基团进行特异性结构修饰，以获得有价值产物的生理、生化反应。甾体化合物的微生物转化类型包括氧化、还原、异构化、缩合、水解、引入杂原子等反应[5]。甾体化合物的微生物转化过程一般由两个阶段组成：第一阶段是培养菌体，以获得足量的菌体和酶；第二阶段是向培养液中加入甾体化合物，完成生物转化的过程[6]。

早有研究表明，HDCA可以作为底物进行微生物转化。Owen R W[7]在1983年发表论文，表明假单胞菌在厌氧条件下可将HDCA转化为6-羟基-3-氧胆-4-烯-24胆烷酸，然而并无相关文献或专利发现HDCA转化为3β-HDCA的方法。本研究的目的在于通过反复筛选获得能对HDCA进行转化的菌株，并对其产物结构进行确证，证明其转化产物为3β-HDCA。研究内容包括针对前期研究筛选获得球形芽孢杆菌AKU218，并进行发酵扩大培养，以HDCA为底物进行转化培养，在培养过程中通过高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）检测确定能否发生转化及转化时间，提取转化产物，进行结构确证，通过与3β-HDCA标准品的HPLC、液相色谱-质谱联用（Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer，LC-MS）、气相色谱-质谱联用（Gas Chromatograph-Mass Spectrometer，GC-MS）对比分析，证明球形芽孢杆菌AKU218可将HDCA转化为3β-HDCA。

2 材料与方法

2.1 菌种

球形芽孢杆菌AKU218由株式会社Chitose研究所提供。

2.2 主要试剂

HDCA为常德云港生物科技有限公司产品，纯度在98.0%以上，其他试剂均为市售分析纯试剂。

2.3 培养基

本研究所用培养基包括马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）、细菌培养基和无机盐培养基，配方如下：（1）PDA培养基：马铃薯200.00 g/L、葡萄糖20.00 g/L、琼脂15.00～20.00 g/L，自然pH。（2）细菌培养基：胰蛋白胨5.00 g/L、酵母膏5.00 g/L、葡萄糖1.00 g/L、磷酸氢二钾1.00 g/L。（3）无机盐培养基：酵母膏0.25 g/L、磷酸氢二钾1.00 g/L、磷酸二氢钾1.00 g/L、硫酸铵1.00 g/L、氯化钠0.10 g/L、硫酸镁0.20 g/L、氯化钙0.02 g/L、硫酸亚铁0.01 g/L。

2.4 实验步骤

2.4.1 孢子和种子制备

将配制好的PDA培养基分装倒入500 mL锥形瓶中，包扎好并标明名称、配制日期和配制人；在灭菌锅内115 ℃灭菌30.00 min，待培养基冷却至50 ℃左右后，无菌操作倒平板（每皿约倒15 mL），室温平置，待凝后制得PDA平板；用接种环挑取球形芽孢杆菌AKU218的菌丝体在PDA平板上划线，置于28 ℃恒温培养箱中培养3 d，得到球形芽孢杆菌AKU218平板。

2.4.2 菌种发酵培养

向玻璃试管中倒入4 mL灭菌后的细菌培养基，细菌培养基配方：用接种环挑取球形芽孢杆菌AKU218的菌丝体接种于细菌培养基中，在28 ℃、120 r/min条件下振荡培养24 h，再将其倒入装有细菌培养基的200 mL锥形瓶中，培养24 h后，3 000 r/min离心10.00 min分离回收菌体。

2.4.3 HDCA转化培养

将所得菌体分散于1 000 mL无机盐培养基中，培养基配方：向培养基中加入5 g HDCA及10.0 μL β-氧化抑制剂2,2’-Bipyridyl，放入有脱氧剂的密闭容器中，于厌氧条件下28 ℃、120 r/min培养36 h。2.4.4 转化产物的分离提取

过滤发酵培养液，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次。合并萃取有机相，真空减压浓缩至干，得转化残渣。取30 mg样品加2 mL甲醇溶解后，流动相定容至20 mL，HPLC检测，对照品用相同方法检测。

2.4.5 转化产物结构解析

另取2.5 μL乙酸乙酯抽提液与50.0 μL含0.1%脂肪酸分析用荧光试剂ADAM甲醇溶液混合后，再添加47.5 μL甲醇，于室温下静置60.00 min，形成荧光标记，然后对样品进行HPLC分析。新购入标准样3β-HDCA用同一方法分析。荧光标记后转化产物进行LC-MS、GC-MS分析。

2.5 分析方法

2.5.1 HPLC分析

本研究将转化产物用流动相（色谱纯乙腈∶0.1%磷酸溶液=90∶10）复溶后，用0.22 μm有机膜过滤除杂，注射器进样，进行HPLC检测。

2.5.2 LC-MS分析

在LC-MS分析前，需要对样品进行处理，转化产物荧光标记方法如2.4.5所述。荧光标记后样品进行LC-MS分析。

2.5.3 GC-MS分析

在GC-MS分析前，需要对样品进行处理，处理方式：（1）甲基酯化反应：向1 mg样品中加入700.0 μL 2N盐酸甲醇溶液后，添加70.0 μL 2,2-Dimethoxypropane于85 ℃下保温1 h。反应后减压蒸发去除溶剂，加入100.0 μL无水甲醇后，再次减压蒸发去除溶剂。（2）TMS化反应：向甲基酯化反应后的样品中添加600.0 μL pyridine∶BSTFA=2∶1的溶液，于80 ℃下保温40.00 min。各标准样处理好后进行GC-MS分析。

3 结果与分析

3.1 球形芽孢杆菌AKU218转化产物的确认

球形芽孢杆菌AKU218在细菌培养基中扩增后进行HDCA转化实验。经HPLC检测发现，在好氧条件下，5.71 min有产物生成；在厌氧条件下，8.44 min左右有产物生成。

3.2 标准品与转化产物对比确认

将球形芽孢杆菌A K U 218的转化产物与标准样3β-HDCA对比，HPLC所得保留时间完全一致。因此，该产物可能为HDCA 3位羟基经过脱氢酶的羟基氧化后，再次加氢还原形成的光学立体结构异构体。

本研究进一步通过LC-MS和GC-MS对转化产物进行结构确证，对胆汁酸荧光标记后的样品进行LC-MS分析。3β-HDCA标准样的LC-MS分析结果表明，在同位体存在的情况下，该化合物以分子质量617和619被检出。GC-MS分析结果显示，二者保留时间一致，MS图谱也完全一致。因此，该转化产物可以被确认为3位羟基由α转化为β的HDCA光学异构体。由于结构得到确定，该产物无需进一步的核磁分析。

4 讨论

本研究发现球形芽孢杆菌AKU218对HDCA有转化作用。通过HPLC分析对比发现，转化产物出峰时间与3β-HDCA标准品出峰时间一致；后通过LC-MS和GC-MS进一步证明转化产物为3β-HDCA。3β-HDCA标准样通过LC-MS分析以分子质量617和619被检出。GC-MS分析结果也证明，转化产物与3β-HDCA标准品出峰时间一致，同时MS图谱也完全一致。由于结构得到确定，该产物无需进一步的核磁分析。本研究表明，3位羟基经过球形芽孢杆菌AKU218脱氢酶的羟基氧化后，再次加氢还原形成光学立体结构异构体3β-HDCA。本研究尚未对球形芽孢杆菌AKU218转化条件对收率的影响进行探索，后续将通过正交试验等方法进行培养基转化条件优化，提高转化效率。

熊去氧胆酸（3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸，UDCA）是HDCA的同分异构体，其杀菌、抗炎和溶解胆汁酸的作用比HDCA强，并且无不良反应。因此，临床上应用UDCA治疗胆结石、胆汁淤积性疾病以及脂肪肝、结肠肿瘤等疾病[8-9]。UDCA也是首个美国食品药品监督管理局批准用于治疗原发性胆汁性肝硬化的药物，具有巨大的临床应用价值。目前，有研究表明，HDCA可经酯化、选择性氧化、环氧化、脱保护等一系列化学反应转化为UDCA[10]，但化学法工艺烦琐、流程复杂、反应条件苛刻，不适用于工业化生产。本次研究结果证明，HDCA可被微生物进行转化利用，这可能预示HDCA存在被微生物转化为UDCA的可能。通过进一步扩大微生物菌株筛选、考察反应条件等方式，有可能筛选出能将HDCA转化为UDCA的菌株。一旦成功，这将是胆汁酸微生物转化领域的又一重大发现，具有巨大的经济价值和社会价值。