香茶菜质量标准研究*

2022-09-08汪正宇郭秀秀赵向阳韩正宾郭明飞

中国药业 2022年17期

汪正宇，郭秀秀，方敏，赵向阳，鲁轮，韩正宾，郭明飞

（1.安徽省宿州市食品药品检验检测中心，安徽宿州234000；2.安徽省质量和标准化研究院，安徽合肥230051；3.安徽省宿州绿源中医药科技有限公司，安徽宿州234000；4.安徽省宿州市市场监督管理局，安徽宿州234000）

香茶菜Rabdosia amethystoides（Benth.）Hara为唇形科植物香茶菜的全草，是民间习用草药，始载于《救荒本草》［1］，别名有铁稜角、蛇总管、山薄荷、蛇通管、小叶蛇总管、母猪花头、盘龙七、王枣子等［2-4］。《救荒本草》描述形态为：“香茶菜，生田野中。茎方窊（五化切）面四楞，叶似薄荷叶，微大，抪叶对生。梢头出穗，开粉紫花，结蒴如荞麦蒴，微小。叶味苦。”《中华本草》［5］指出，“今唇形科香茶菜与《救荒本草》中香茶菜形态描述相符”，故《救荒本草》中记载的香茶菜与现代本草香茶菜为同一植物。《中国植物志》［2］记载，香茶菜生于海拔为200～920 m的林下或草丛中湿润处，产自广东、广西、贵州、福建、台湾、江西、浙江、江苏、安徽及湖北。香茶菜主要活性成分有二萜类［6-9］、三萜类［10-11］、挥发油类［12-13］等成分，具有较强的抗菌消炎［7，14-15］、抗肿瘤［7，15-16］、保护肝损伤［17-19］等药理活性，其中萜类成分为抗肿瘤的主要活性成分。目前，以香茶菜入药的制剂有胃复春片、人参香茶片、抗癌平等［20-21］。《中国药典》未收载香茶菜药材，2016年版《江苏省中药材标准》［22］、2017年版《浙江省中药材标准》［23］及2019年版《安徽省中药饮片炮制规范》［24］中均有收载，参照上述标准可拟订“性味与归经”“功能与主治”“用法与用量”“注意”“处方应付”“贮藏”项，但均无香茶菜中活性成分的定量检测要求。本研究中从定性鉴别、检查项及含量测定等方面建立了香茶菜的质量标准，旨在为其质量控制和进一步开发利用提供依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

2695型高效液相色谱仪（美国沃特世公司），配有2489型紫外-可见光检测器和Empower色谱工作站；DM750型生物显微镜（德国徕卡公司，Toup-CamE3CMOS成像系统）；Camag TLC Scanner3型薄层扫描仪（瑞士卡玛公司）；FP240型精密干燥箱（德国宾德公司）；KSL-1200X-M型高温箱式炉（27 L，合肥科晶材料技术有限公司）；TA-27型超声波清洗器（湖北鼎泰高科有限公司，功率为700 W，频率为40 kHz）；AB-135S型电子天平（精度为0.01 mg），BSA 124S型电子天平（精度为0.1 mg），均购于德国赛多利斯公司。

1.2 试药

齐墩果酸对照品（批号为110709-201808，含量91.1%），熊果酸对照品（批号为110742-201220，含量99.3%），均购于中国食品药品检定研究院；香茶菜对照药材（成都植标化纯生物有限公司，批号为200416）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国天地有限公司）；水为纯化水，其他试剂均为分析纯。香茶菜共13批，其中宿州市王枣子药材种植基地、王二嫂子药材种植基地采集10批，安徽省中药材标准起草领导小组提供3批，经安徽省中医药大学刘金山教授鉴定为正品。样品信息见表1。

表1 香茶菜药材样品信息Tab.1 Information of Rabdosia amethystoides samples

2 方法与结果

2.1 性状鉴别［2］

香茶菜样品和《中华本草》描述一致，为多年生本草，高0.3～1.5 m；根茎肥大，疙瘩状，木质；茎直立，四棱形，被倒向柔毛；叶对生；叶柄长0.2～2.5 cm；叶片卵状披针形，长0.8～11.0 cm，宽0.7～3.5 cm，先端渐尖，基部楔形下延于叶柄，边缘基部以上具圆齿，两面被短柔毛，有时近五毛，均具腺点。二歧聚伞花序多花，组成顶生疏散的圆锥花序；苞片针状、小，但较显著；花萼钟形，长约2.5 mm，外面被极短硬毛或近无毛，并具腺点，萼齿5，三角形，近相等，花萼白色、蓝白色或紫色，长约7 mm，外面被短柔毛，内面无毛，上唇外反，先端4圆裂，下唇阔圆形，内凹呈舟形；雄蕊4，二强，内藏；子房4裂，花柱与雄蕊等长，柱头2浅裂；花盘杯状。小坚果卵形，褐色。花期6～10月，果期7～11月。

2.2 显微鉴别（药材粉末）

本品药材粉末灰棕色。叶上、下表皮细胞呈类多角形或不规则形，表面有众多非腺毛和腺鳞，气孔不定式（图1 A）；非腺毛多碎断，完整者4～6个细胞，表面有疣状突起，顶端尖或稍弯，部分细胞常缢缩（图1 B）；腺鳞头部扁球形，2～4个细胞，直径20～38 μm（图1 C）；韧皮纤维细长梭形（图1 D）；木纤维成束或散在，细胞壁不规则增厚（图1 E）；石细胞可见类方形、长方形或不规则形，胞腔较大，有细密纹孔（图1 F）。

A.叶上、下表皮细胞及气孔B.非腺毛C.腺鳞D.韧皮纤维E.木纤维F.石细胞图1香茶菜粉末显微鉴别（×200）A.Upper and lower epidermal cells and stomatas of leaves B.Non-glandular hairs C.Glandular scales D.Bast fibers E.Wood fibers F.Stone cellsFig.1 Microscopic identification of Rabdosia amethystoides powder（×200）

2.3 薄层色谱鉴别

取样品粉末0.5 g，加乙醇20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2 mL使溶解，滤过，作为供试品溶液。另取香茶菜对照药材0.5 g，同法制得对照药材溶液。取熊果酸对照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的对照品溶液。取熊果酸对照品溶液、对照药材溶液及13批样品的供试品溶液，照2020年版《中国药典（四部）》通则0502薄层色谱法试验，吸取上述3种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-丙酮-甲酸（4.5∶0.5∶1∶0.1，V/V/V/V）为展开系统，于相对湿度低于70%环境下展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液和对照品溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点，详见图2。

S.熊果酸对照品溶液S′.对照药材溶液1-13.供试品溶液图2香茶菜薄层色谱图S.Ursolic acid reference solution S′.Reference medicinal material solution 1-13.Test solutionFig.2 TLC chromatograms of Rabdosia amethystoides

2.4 水分、总灰分及酸不溶性灰分检查

采用2020年版《中国药典（四部）》通则0832水分测定法第二法（烘干法）测定含水量，通则2302总灰分测定法测定总灰分和酸不溶性灰分含量。结果13批样品水分为6.62%～9.45%，平均7.72%；总灰分为3.22%～5.64%，平均4.61%；酸不溶性灰分为0.08%～0.26%，平均0.18%。拟订水分限度为“不得过10.0%”，总灰分限度为“不得过6.0%”。因酸不溶性灰分较少，课题组认为香茶菜引入外源性无机盐杂质较少，香茶菜中酸不溶性灰分风险可控，故酸不溶性灰分的检查不纳入本标准。详见表2。

表2 水分、总灰分、酸不溶性灰分测定结果（%）Tab.2 Results of content determination of moisture，total ash and acid-insoluble ash（%）

2.5 浸出物测定

采用2020年版《中国药典（四部）》通则2201项下浸出物测定法测定水溶性和醇溶性浸出物含量。结合前期考察T1-T6批样品的热浸法结果，稀乙醇和水浸出物含量较高，故冷浸法提取时着重考察了上述2种溶剂，结果热浸法优于冷浸法。因香茶菜植物主要药效成分为二萜类、三萜类化合物，结合指标成分含量测定结果，确定含量最高的浸出物试验溶剂为乙醇和70%乙醇。由表3可知，70%乙醇浸出物含量较乙醇热浸法高，故确定以70%乙醇为提取溶剂，采用醇溶性浸出物测定法的热浸法测定香茶菜浸出物。由表3可知，13批样品采用70%乙醇热浸法提取浸出物均值为15.79%。考虑个别样品的测定数据，将限度适当下浮，拟订浸出物限度为“不得少于8.5%”。

表3 浸出物测定结果（%）Tab.3 Results of content determination of extract（%）

2.6 齐墩果酸和熊果酸含量测定

2.6.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-甲醇-含12 mmol/L羟丙基-β-环糊精的0.5%醋酸铵溶液（67∶12∶21，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：210 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL。在此色谱条件下，供试品溶液色谱图中，杂质峰对主峰无干扰，齐墩果酸与熊果酸的分离度大于1.5，峰对称因子在0.90～1.20之间，理论板数以齐墩果酸及熊果酸峰计大于8 000，对照品溶液重复进样5次的RSD不超过1.5%，且空白试剂无干扰。色谱图见图3。

2.6.2 溶液制备

取齐墩果酸对照品、熊果酸对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含齐墩果酸0.202 2 mg、熊果酸0.314 4 mg的混合对照品贮备液；精密量取贮备液5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容，混匀，用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得混合对照品溶液。取香茶菜药材粉末（过2号筛）及对照药材各1.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇50 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）60 min，放冷，再称定质量，加乙醇补足减失的质量，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.6.3 方法学考察

线性关系考察：精密吸取2.6.2项下混合对照品贮备溶液0.2，0.5，1.0，2.0，3.0，5.0，8.0，10.0 mL，分别置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容，摇匀，得系列质量浓度的混合对照品溶液，按2.6.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图峰面积，以对照品溶液质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得齐墩果酸和熊果酸的线性回归方程分别为Y齐=10 431X齐+18 547（r=0.997 3，n=8）、Y熊=8 894X熊+24 743（r=0.997 4，n=8）。结果表明，齐墩果酸和熊果酸质量浓度分别在4.04～202.20 μg/mL和6.29～314.40 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

1.齐墩果酸2.熊果酸A.空白试剂B.对照品溶液C.供试品溶液图3高效液相色谱图1.Oleanolic acid 2.Ursolic acidA.Blank solvent B.Reference solution C.Test solutionFig.3 HPLC chromatograms

定量限确定：取混合对照品溶液，按10倍稀释，得系列定量限检测溶液，按2.6.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图峰面积，以信噪比（S/N）为10∶1时的质量浓度为定量限。结果齐墩果酸和熊果酸的定量限分别为2.12 μg/mL和3.14 μg/mL。

精密度试验：取2.6.2项下混合对照品溶液，按2.6.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录色谱图峰面积。结果齐墩果酸和熊果酸峰面积的RSD分别0.40%和0.62%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批（编号为T1）香茶菜药材粗粉，按2.6.2项下方法制备供试品溶液，分别于0，3，6，9，12，18，24 h时测定，记录色谱图峰面积。结果齐墩果酸和熊果酸峰面积的RSD分别为1.83%和1.15%（n=7），表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

重复性试验：取同一批（编号为T1）香茶菜药材粗粉，按2.6.2项下方法平行制备供试品溶液6份，按2.6.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图峰面积。计算含量。结果齐墩果酸含量分别为0.455，0.470，0.467，0.464，0.470，0.464 mg/g，熊果酸含量分别为0.718，0.722，0.728，0.722，0.727，0.724 mg/g，RSD分别为1.17%和0.40%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的香茶菜（编号为T6）粗粉0.625 g，精密称定，平行6份，置100 mL具塞锥形瓶中，分别加入每1 mL含齐墩果酸0.210 4 mg、熊果酸0.333 0 mg的溶液1.5 mL，按2.6.2项下方法制备供试品溶液，按2.6.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图峰面积，并计算加样回收率及RSD。结果见表4。

表4 香茶菜加样回收试验结果（n=6）Tab.4 Results of the recovery test of Rabdosia amethystoides（n=6）

2.6.4 样品含量测定

取2.6.2项下混合对照品溶液、对照药材溶液及13批药材样品供试品溶液，按2.6.1项下色谱条件进样测定3次，记录色谱图峰面积，分别按外标法计算含量。由表5可知，对照药材中齐墩果酸及熊果酸含量和样品中含量相当，13批香茶菜样品中齐墩果酸含量为0.018%～0.082%、平均0.037%，熊果酸含量为0.055%～0.167%、平均0.087%，二者含量总和为0.074～0.249%、平均0.124%，表明不同产地及不同采样地点，二者含量存在一定差异。拟订含量为“本品按干燥品计算，含齐墩果酸（C30H48O3）和熊果酸（C30H48O3）的总量不得少于0.06%。”

表5 香茶菜含量测定结果（n=3，%）Tab.5 Results of the content determination of oleanolic acid and ursolic acid in Rabdosia amethystoides（n=3，%）

3 讨论

3.1 色谱条件优化

齐墩果酸及熊果酸是普遍存在于中草药中的三萜类化合物，二者的化合物结构十分相似，属同分异构体。本研究中先后参考《中国药典》收载的木瓜、枇杷叶、翼首草等齐墩果酸及熊果酸含量测定项下的色谱条件，结果混合对照品溶液色谱峰分离不理想，且重复性不好。而在流动相中加入适宜浓度的羟丙基-β-环糊精，在分离手性化合物方面分离作用较好，通过反复试验，摸索出流动相中加入12 mmol/L羟丙基-β-环糊精，结果2个目标化合物分离度均达到2.5以上，且在流动相中加入1%三乙胺能有效改善峰形。柱温、检测波长、进样量等其他参数参考药典相应品种方法都有较好的系统适用性。

3.2 测量结果分析

考察薄层色谱鉴别条件时，分别考察不同提取条件［提取溶剂（甲醇、乙醇、氯仿、乙醚）、提取方式（超声、加热回流）］、不同厂家薄层板、不同点样量、不同点样方式（点状、条带状）及不同温湿度等条件，结果以乙醇作为溶剂，超声提取分离效果较好，该方法对其他条件的耐受性较好，能满足试验要求，测得色谱图斑点显色清晰。由表5可知，13批样品中齐墩果酸和熊果酸含量存在一定差异，本研究中选取香茶菜地上部分开展试验，引起含量差异的原因可能与采样地点或季节有关，课题组将在后续工作中对此进行探讨。