载siRNA的PLGA-b-PEG纳米粒制备及初步体外评价*

纪刚剑，林 雯，史琼枝，李银科

（1.湖北省武汉市第三医院·武汉大学附属同仁医院，湖北 武汉430060；2.黄石爱康医院，湖北 黄石435000；3.中国人民解放军中部战区总医院，湖北 武汉430070）

全球第1个核糖核酸（RNA）干扰药物patisiran（商品名Onpattro）于2018年10月8日获得美国食品药物管理局（FDA）批准上市［1］，小干扰核糖核酸（siRNA）目前已成为生物技术药物研究领域的研究热点。但裸露的siRNA易被血清中的核酸酶降解，且易被肾脏快速清除［2］。siRNA相对分子质量较大（约14 000），所携带的负电荷制约其穿越体内多种生物屏障［3］。因此，实现siRNA的有效递送须构建高效的载体递送系统。原癌基因c-myc的活性改变是启动和维持细胞癌变状态的重要因素，在体内正常环境下的表达是被严格控制的。研究表明，抑制c-myc基因可产生显著的抗癌效果。针对性抑制c-myc基因的siRNA应用前景极好［4］。微泡与超声技术相结合可提供一种非侵入式的药物靶向递送方法，通过增加肿瘤部位的血管通透性而提高药物载体（微泡）的递送效率［5］。但微泡被超声激发破坏后，其中包载的药物瞬间释放完毕，难以实现药物在靶部位的持续释放［6］。聚乳酸-羟基乙酸共聚物-b-聚乙二醇（PLGA-b-PEG）是由聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）和聚乙二醇（PEG）构成的双单元共聚物，具有两亲性、生物相容易降解性、长循环性等特点。本研究中制备以PLGA-b-PEG为基质的纳米粒，包载可抑制c-myc基因的siRNA（5′-AACGUUAGCUUCACCAACAUU-3′）作为模型药物［7］。将该纳米粒与微泡一同注入体内，纳米粒和微泡将随着血液循环流经肿瘤部位，在体外的局部定点超声作用下，微泡发生的空化作用暂时打开肿瘤血管壁屏障，纳米粒借机进入肿瘤部位释放包载的siRNA；持续的局部超声刺激可加快药物在病灶部位的释放速率，实现深部位肿瘤的siRNA定向、定速释放。研究表明，在超声波刺激诱导微泡的惯性空化作用下，肿瘤局部的血管通透性增加，搭载siRNA的PLGA-b-PEG纳米粒更易透过血管壁，进入肿瘤部位释药［8］，可增强肿瘤部位对纳米粒子的实体瘤高通透性和滞留效应（EPR），从而实现药物的靶向递送。目前，关于c-myc基因的siRNA递送方案尚未见文献报道。为此，本研究中探讨了载siRNA的PLGA-b-PEG纳米粒的制备工艺，并对其进行初步体外评价，以期为c-myc基因表达异常的相关实体瘤的基因治疗提供参考。现报道如下。

1 仪器、试药与细胞

1.1 仪器

RE52CS型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；3K15型冷冻离心机（美国Sigma公司）；AH100D型脂质体挤出器（加拿大Avestin公司）；JY92-ⅡD型细胞超声破碎仪（宁波新芝生物科技有限公司）；7500型透射电子显微镜（日本日立公司）；NanoWizarc®型原子力显微镜（德国JPK Instruments AG公司）；NICOMP 380ZLS型Zeta电位/粒度分析仪（美国Santa Barbara公司）；RF-5301型荧光分光光度计（日本岛津公司）；Bio-rad680型酶标仪（美国伯乐公司）；Intelect®2776型超声波治疗仪（美国Chattanooge公司，频率为1 MHz，功率为4.5 W）。

1.2 试药

PLGA-b-PEG（LA/GA=50/50，相对分子质量为5 000，西安瑞喜生物科技有限公司，批号为BV2032）；siRNA和FAM-siRNA（上海吉玛制药技术有限公司，批号均为20160613）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司，批号为20170118）；RPMI-1640培养基（批号为8119064），DMEM培养基（批号为8117167），均购于美国Gibco公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT，美国Sigma公司，批号为M-2128）；其余试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 细胞

人乳腺癌细胞MCF-7与结肠癌细胞HT-29由军事科学院军事医学研究院惠赠，分别传代于第3代、第4代。

2 方法与结果

2.1 纳米粒制备

采用复乳法制备纳米粒［6］。取PLGA-b-PEG 100 mg，精密称定，置30 mL烧杯中，加入10 mL二氯甲烷（含3%司盘-80，m/V）溶解基质材料，磁力搅拌，缓慢滴加2 mL siRNA液［2 μmol/mL，使用前15 min配制，由经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的含亚精胺水溶液配制，氮磷比为15∶1］，冰浴条件下超声乳化（功率为30 W，工作2 s，停止2 s）120 s制备初乳；将初乳倒入60 mL 1%吐温-80（m/V）水溶液中，冰浴条件下超声乳化（功率为100 W，工作2 s，停止2 s）120 s制备复乳；磁力搅拌4 h，挥尽有机溶剂，固化，0.45 μm聚碳酸酯膜滤过，超滤管（截留相对分子质量100 000）离心（3 000g）过滤纯化，经DEPC处理的纯化水洗涤3遍，所得混悬液密封储存于4℃冰箱。将siRNA液换成FAM-siRNA液，同法制备FAM-siRNA纳米粒。

2.2 理化表征

形态：分别采用透射电子显微镜和原子力显微镜对所制备的siRNA纳米粒进行形态观察［7］。取少量纳米粒样品，经蒸馏水适当稀释，滴加于电镜专用样品铜网，1%磷钨酸染色，自然干燥，采用透射电子显微镜进行形态观察。另取纳米粒样品少量，用蒸馏水稀释，滴加于云母片，自然干燥，采用原子力显微镜进行形态观察。由图1可知，制备的载药纳米粒基本形态均匀，外形为球形，粒子直径为100 nm。

图1 不同显微镜下siRNA纳米粒形态观察A.TEM B.AFM（fast）Fig.1 Morphological observation of nanoparticles loading the siRNA with different microscopes

粒径分布和Zeta电位：采用Zeta电位/粒度分析仪测定。仪器参数设置，激光扫描波长639 nm，入射光与散射光的夹角90°，测定温度23℃。由图2可知，所制备纳米粒的平均粒径为（101.5±6.3）nm，多分散系数（PDI）为0.095±0.008，Zeta电位为-（31.7±4.5）mV。粒径仪测定的粒径结果与透射电子显微镜、原子力显微镜的结果一致。

图2 siRNA纳米粒粒径分布Fig.2 Particle size distribution of nanoparticles loading the siRNA

包封率：用TE缓冲液［10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA］配制系列FAM-siRNA标准溶液（质量浓度为0.03～0.27 μg/mL），采用荧光分光光度法进行测定，设置仪器参数Ex/Em为490/515 nm［9］，以荧光强度（F）对样品浓度（C）进行线性回归，得回归方程F=0.449 11C+0.396 34（R2=0.999 7）。结果表明，FAM-siRNA浓度在2～20 nmol/L范围内与荧光强度线性关系良好。冷冻干燥纳米粒样品混悬液，精密称定，加入乙腈溶解，TE缓冲液稀释，测定荧光强度，代入回归方程，计算总体载药量（L总）；用超滤管（截留相对分子质量100 000）离心（3 000g）分离纳米粒悬液，测定游离的药物量（L游），计算纳米粒的包封率。包封率=（L总-L游）/L总×100%。结果FAM-siRNA纳米粒的包封率为（57.6±4.8）%。

2.3 稳定性考察

取FAM-siRNA纳米粒样品悬液0.5 mL，置10 mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中，混合，密封，置4℃冰箱，第0天和制备后第30天取样，测定粒径、电位和包封率，考察4℃条件下的制剂稳定性［9］。结果在4℃条件下放置30 d，纳米粒的粒径为（103.3±5.7）nm，PDI为0.097±0.009，Zeta电位为-（32.5±5.2）mV，包封率为（55.2±5.7）%；4℃条件下第0天，粒径为（101.5±6.3）nm，PDI为0.095±0.008，Zeta电位为-（31.7±4.5）mV，包封率为（57.6±4.8）%。可见，第0天与第30天测定结果基本一致，表明4℃环境下纳米粒在PBS中的稳定性良好。

2.4 体外释药考察

采用透析袋法考察。精密量取样品悬液1.0 mL，置透析袋（截留相对分子质量100 000）中，两端夹紧，置100 mL PBS（pH 7.4）中，37℃恒温摇床（转速为75 r/min）振摇。平行配制12份，分为超声组和未超声组。超声组在1 h时利用Intelect®2776型超声波治疗仪超声（频率为1 MHz，功率为1 W/cm2）处理20 min。分别于0，1，2，4，6，8，12，24，48 h时取样，同时补加释放介质［9］，参照包封率测定项下测定释放的FAM-siRNA浓度，计算累积释放率，绘制释药曲线。由图3可知，纳米粒在体外模拟条件下释药平稳、持续。前24 h的累积释放量为载药量的65%～75%，余下部分于后续24 h内基本释放完毕。超声组FAM-siRNA于处理后2 h的累积释放量较未超声组高10%，表明制备的纳米粒具有一定的超声刺激释药特性，结合声敏微泡可能促进在靶部位的释药。

图3 FAM-siRNA纳米粒的体外释药曲线Fig.3 Profiles of drug release in vitro of FAM-siRNA nanoparticles

2.5 MTT法检测载体对细胞增殖的影响

将MCF-7与HT-29细胞以1.0×104个/孔的密度分别接种于48孔板中，37℃及5%CO2的培养箱中培养24 h［10-11］。分别设立空白对照组（Blank）、超声空白对照组（Blank+US）、siRNA组（siRNA）、空白纳米粒组（Blank NP）、siRNA纳米粒组（siRNA NP）、siRNA纳米粒超声组（siRNA NP+US）。加样体积为25 μL，含药组的每孔siRNA浓度为25 nmol/L。超声处理（功率为1 W/cm2，频率为1 MHz）siRNA NP+US。加样后继续培养60 h，弃去原培养液，加入培养液［含20 μL MTT（5 mg/mL）］200 μL培养4 h，弃去培养液，加入200 μL二甲基亚砜（DMSO）溶解，采用酶标仪于540 nm波长处测定吸光度，计算细胞存活率。由图4可知，载药纳米粒组（siRNA NP，siRNA NP+US）与其他组（Blank，Blank+US，siRNA，Blank NP）之间的（MCF-7，HT-29）细胞存活率有显著差异（P＜0.05）；载药纳米粒组和其他组（MCF-7，HT-29）组内无显著差异（P＞0.05）。从趋势上看，siRNA的存活率略低于Blank，siRNA NP和siRNA NP+US均低于siRNA。

图4 体外细胞活性（n=6）Fig.4 Cell viability in vitro（n=6）

3 讨论

纳米粒的基质材料PLGA-b-PEG具有两亲性，而siRNA亲水性强，难以直接包裹进入纳米粒的内部疏水区域，故本研究中采用复乳法制备纳米粒，以提高药物包封率。处方中采用了2种乳化剂，根据乳化剂的亲水/亲油平衡系数（HLB），亲油性的司盘80（HLB=4.3）用于稳定初乳W/O，亲水性的吐温80（HLB=15.0）用于复乳W/O/W的稳定［12-13］。为了提高siRNA的稳定性和包封率，处方中的siRNA先用带正电的亚精胺中和，再包载入纳米粒，将减少乳化超声过程中产生的热量对siRNA的破坏，于冰浴条件下超声乳化吸收多余热量［14-16］。此外，为减少环境中核酸酶对药物的降解作用，使用前均用RNA酶灭活剂DEPC对试验器具进行预处理［9］。

考虑缩短制备工艺的过滤时间，本研究中采用0.45 μm滤膜进行初滤，超滤管进行纳米粒的过滤纯化，未采用脂质体制备中常用的100～200 nm滤膜进行过滤。纳米粒的刚性比脂质体大，过膜阻力大于脂质体，故采用预过滤后再超滤。粒径100 nm的纳米粒常用于体内药物的靶向递送［17-19］，故选择纳米粒的粒径为100 nm。试验制备的空白纳米粒的Zeta电位为-22 mV，而含siRNA的纳米粒的Zeta电位为-31 mV，这可能与部分未包封的siRNA吸附在纳米粒表面有关［20］。由于基质材料PLGA-b-PEG和模型药物均带负电，根据同种电荷相斥的原理，可能导致siRNA药物在PLGA-b-PEG材料中的包封率较低。

由于目前直接测定样品中siRNA含量的方法较复杂，本研究中采用标记后的FAM-siRNA代替siRNA进行包封率和释放度的考察。但这种荧光标记的siRNA可能并不能完全反映实际的siRNA情况，最终应以凝胶电泳法测定结果为准［21］。由图3可知，siRNA的释放速率前快后慢，可能与在纳米粒内部的药物需通过一段时间的扩散才能释放到粒子表面有关。在超声作用下，超声组FAM-siRNA于处理后2 h的累积释放率较未超声组高10%，提示超声作用有助于药物释放。本研究中制备的纳米粒在超声作用下可加快药物释放，且具有缓释效果，可确保载体在进入位点后持续释药一段时间，延长药物的靶向治疗效果。

由图4可知，超声作用、空白载体与游离的siRNA几乎均不影响MCF-7和HT-29肿瘤细胞的活性，游离的siRNA对2种肿瘤细胞存在一定抑制作用，但无统计学差异。可能与游离的siRNA在培养基中易被降解，且穿透细胞膜的能力低有关。载有siRNA的纳米粒可被细胞摄入，显现出较强的细胞抑制作用。在超声波作用下，siRNA NP+US显现出较强的肿瘤细胞活性抑制作用，这可能与超声波可临时打开细胞膜屏障有关［22］。此外，预试验中，细胞培养48 h时各组间的差异无统计学意义，而培养60 h才表现出显著差异，提示细胞培养时长对结果有很大影响。

本研究中意图构建的siRNA递送策略是通过超声刺激肿瘤局部的声敏微泡产生空化作用而提高肿瘤部位的血管通透性，进而提高纳米粒在肿瘤部位的EPR效应而进入靶部位释放siRNA，涉及超声波功率、频率、作用时长及微泡的理化特性等因素。本研究结果仅限于载体的制备方法和初步的体外评价，后续研究将作深入探讨。

综上所述，PLGA-b-PEG包裹的siRNA纳米粒具有超声刺激靶向释药特性，在siRNA肿瘤靶向给药应用方面具有较好的潜力。