干燥综合征合并特发性肺纤维化miRNA表达谱的变化及生物标志物的研究*

赵 珊，张 虹，梅 坚，毕丹艳

（云南省第一人民医院 风湿免疫科，650032）

干燥综合征（Sjogren/s syndrome，SS）是一种慢性和全身性自身免疫性疾病，以淋巴细胞浸润和身体产生水分的外分泌腺（如泪腺和唾液腺）功能的丧失为其定义的表现。它是第二常见的风湿性自身免疫性疾病，影响0.5%～1%的普通人群［1］。泪腺和唾液外分泌腺的进行性炎症与功能丧失有关，导致衰弱的干眼和干嘴。SS与包括脑、肺和肝在内的内脏器官炎症增加有关，并使b细胞淋巴瘤的发病风险增加44倍［2］。SS可在没有其他自身免疫性疾病（原发性SS，PSS）的情况下发生，或伴有类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮甚至可能导致特发性肺纤维化［3，4］。干燥综合征合并特发性肺纤维化病情加剧，伴随干咳，进行性呼吸困难，晚期常因心肺功能衰竭而死亡。有研究［5］对175例pSS患者进行职业暴露危险因素调查，观察到接触二氯甲烷、全氯乙烯、氯化溶剂、苯等芳香族溶剂与pSS发病明显相关，提示职业暴露是pSS的危险因素。Barragan-Martinez［6］等人报道了三氯乙烯、苯和芳香族有机溶剂对免疫系统的影响，研究结果提示暴露在溶剂中会诱发氧化应激的增强，修饰参与上皮细胞凋亡的基因转录，这可能是干燥综合征合并肺纤维化的一种病理分子机制。

目前，本病的发病机制没有阐明，尚没有针对性的药物治疗策略，临床治疗中以对症治疗和替代疗法缓解病情为主。近年来随着生物信息学的快速发展，结合芯片和高通量测序技术的不断革新，为理解各类疾病发展的分子机制和病理基础带来了无限可能［7］。本研究拟通过芯片检测分析干燥综合征合并特发性肺纤维化患者血清中miRNA表达差异，发掘区别于原发性干燥综合征的潜在生物标志物，在临床中采取针对性诊疗策略。本课题经云南省第一人民医院伦理委员会审核并批准，纳入研究对象的患者均知晓并签署知情同意书。

1 对象与方法

1.1 研究对象与分组

本研究将样本分为干燥综合征组与干燥综合征合并肺纤维化组，本研究采用NCBI的基因表达综合数据库（GEO数据库）获得干燥综合征及干燥综合征合并肺纤维化的基因表达谱数据。干燥综合征组3例，干燥综合征合并肺纤维化患者3例，就诊于云南省第一人民医院。3例干燥综合征患者为对照组，平均年龄为（55.67±4.78）岁，病程为（10.67±1.70）月；3例干燥综合征合并特发性肺纤维化患者作为观察组，平均年龄为（57.67±3.68）岁，病程为（11.00±2.45）月；6例患者均为女性。各组基本临床资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 血清样本的RNA提取与基因芯片检测miRNA

Agilent Human miRNA Microarray Kit，Release 21.0，8×60K（DesignID：070156）芯片实验以及6个样本的数据分析在上海欧易生物医学科技有限公司（上海，中国）进行。芯片上面包含了2 570个成熟的miRNA。

1.3 miRNA表达差异分析

采用基于二项分布的DESeq进行分析，从差异倍数和校正后的显著水平（Padj/q值）两个水平进行评估，以q值＜0.01、log2（差异倍数）＞1.5为筛选条件对差异miRNAs进行筛选。

1.4 qRT-PCR分析

根据说明书，总RNA反转录，得到cDNA作为模板，扩增目的基因及内参。用Prime Script TMRT反转录试剂盒和TB Green Premix Ex TaqTMⅡ定量试剂盒，进行miRNA表达水平验证。反应条件：95℃5 min；95℃5 s，60℃20 s，95℃15 min，40个循环。采用2-ΔΔCt计算基因的表达水平，其中GAPDH作为内参。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 差异基因分析

利用R软件分析血清样本miRNA表达谱，共得到差异表达基因13个，包括上调基因6个和下调基因7个。绘制差异miRNA表达基因火山图（图1）。

Fig.1 Plot of differential miRNA volcanoes between two groups.Red dots indicate significantly up-regulated expression（log2-fold change＞1，P＜0.05）compared to miRNAs from two groups of serum samples，blue dots indicate significantly down-regulated expressed genes（log2-fold change＜-1，P＜0.05），and gray dots indicate nonsignificant differences.The vertical coordinate represents the adjusted P-value（Padj），the smaller the adjusted Pvalue，the more significant the difference and the larger the corresponding-log10（Padj）value.Thus，the dots in the upper left and upper right corners indicate down-regulated and up-regulated genes，respectively，with highly significant differences

2.2 靶基因预测

分别选取上调最明显的6个miRNA：hsa-miR-6740-5p，hsa-miR-4507，hsa-miR-6775-5p，hsa-miR-4281，hsa-miR-4459，hsa-miR-6089和下调的7个miRNA：hsa-miR-6873-3p，hsamiR-4290，hsa-miR-6858-3p，hsa-miR-574-3p，hsa-miR-92b-3p，hsa-miR-3151-3p，hsa-miR-6886-3p，使用miRDB和miRWalk在线预测工具，对差异miRNA进行潜在的靶基因预测分析，交互得到363个下游靶基因（图2）。

Fig.2 Possible target genes of differential miRNAs screened by two online prediction tools，miRWalk and miRDB

2.3 KEGG和GO富集分析

GO分析：在生物过程方面，主要富集与细胞代谢过程、细胞生长过程的调节、上皮细胞增殖等过程。在细胞组成方面主要富集于细胞质膜、染色质、受体复合物等细胞成分中［8］。分子功能方面主要富集与转录辅助因子活性、氨基多糖结合、染色质结合、细胞粘附分子结合等分子功能。KEGG分析显示主要集中于PI3K、AKT信号通路、癌症中的转录失调、乙型肝炎等信号通路。结果显示wnt信号通路差异明显，是特发性肺纤维化的关键信号通路（图3，4）。

Fig.3 GO enrichment analysis

Fig.4 KEGG enrichment analysis

2.4 qRT-PCR验证表达有差异的miRNA在血清中的表达水平

根据差异倍数，我们选择差异最明显的前五个miRNA进行验证。结果如表1所示，miRNA在两组血清样品中的表达趋势与芯片检测所得表达趋势一致，且与干燥综合征组比较，干燥综合征合并肺纤维化组血清中miR-6886-3p，miR-6873-3p，miR-574-3p表达水平明显下调，差异显著，具有统计学意义。相反的，miR-6740-5p和miR-4507在干燥综合征合并肺纤维化组中表达上调，差异明显（P＜0.05）。

Tab.1 The relative expressions of miRNA in the serum were detected by RT-qPCR analysis（±s，n=3）

Tab.1 The relative expressions of miRNA in the serum were detected by RT-qPCR analysis（±s，n=3）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs desiccation syndrome（PSS）

Group PSS PSS+IPF miR-6886-3p 1.472±0.867 0.088±0.100*miR-6873-3p 0.950±0.551 0.080±0.053*miR-574-3p 3.269±1.037 0.229±0.045**miR-6740-5p 1.889±0.878 9.861±6.284*miR-4507 1.122±1.174 5.702±3.349*

3 讨论

干燥综合征是一种自身免疫性疾病，而非口干。眼干的单一性疾病。目前，诊断及用药治疗策略尚缺少循证医学证据佐证，临床中更多地为经验性用药［9，10］。miRNA可以与下游靶基因结合，竞争性抑制靶基因的表达。通常一个miRNA可以调控多个靶基因，而一个靶基因可能受到多个miRNA的调控，共同组成调控网络［11］。我们从多靶点，多通路的研究角度出发，深入探究干燥综合征及特发性肺纤维化的发病机制及其潜在的治疗靶点，探讨特异性miRNA在诊断干燥综合征及特发性肺纤维化中的具有重要意义。

miRNA芯片检测技术具有高通量［12-14］，灵敏性好，样本需求低等特点。目前也应用于多种复杂疾病的诊断与新药研发。本研究借助miRNA芯片，成功筛选出干燥综合征合并特发性肺纤维化疾病相关的13个差异miRNA。和干燥综合征比较，合并特发性肺纤维化患者血清中hsa-miR-6740-5p，hsa-miR-4507，hsa-miR-6775-5p，hsa-miR-4281，hsa-miR-4459，hsa-miR-6089表 达 上 调，hsa-miR-6873-3p，hsa-miR-4290，hsa-miR-6858-3p，hsa-miR-574-3p，hsa-miR-92b-3p，hsamiR-3151-3p，hsa-miR-6886-3p表达下调。此外，对miRNA的靶基因进行KEGG富集分析，结果提示Wnt信号通路和细胞衰老的相关信号通路的调控与肺纤维化有密切关系。有报道称Wnt信号通路是通过细胞表面受体将信号从细胞外传递到细胞内发挥调控作用［15，16］。因此Wnt信号通路已经成为抑制纤维化的潜在靶点。有研究发现［17］Lrp5缺失小鼠影响Wnt/β-catenin信号通路，减弱博来霉素诱导的肺纤维化。李［18］等发现CGRP可以抑制eIF3a上调p27的表达，抑制肺成纤维细胞从而抑制肺纤维化的发展。Tao等［19］也发现沉默FZD7可抑制TGF-β1诱导的肺纤维化，并且能够通过Wnt信号通路进行信号转导参与组织纤维化的调节。此外，田［20］等证实益气化瘀化痰方可以通过下调TGF-β1，调控的TGFβ/Snail信号轴，减缓博来霉素诱导的肺纤维化损伤。我们芯片检测结果证实了Wnt信号通路涉及的分子可能是干燥综合症合并特发性肺纤维化的关键标志物，这对于特发性肺纤维化的诊断及潜在的新药研发具有指导意义。此外，有报道证实有机溶剂与自身免疫性疾病有关，如系统性红斑狼疮、系统性硬化症，类风湿关节炎和干燥综合征等［21］。干燥综合征作为一种自身免疫性疾病，职业暴露尤其是苯等芳香族有机溶剂，有加剧职工免疫系统紊乱的风险，诱发自身免疫功能失衡，因此关键生物标志物的发现对临床早期诊断和治疗职业暴露诱发的肺纤维化具有重大意义。

综上所述，本研究利用基因芯片研究干燥综合征合并特发性肺纤维化的差异表达miRNAs及下游信号通路。研究发现干燥综合征合并特发性肺纤维化患者血清中存在13个差异miRNA，wnt信号通路在特发性纤维化病理过程中发挥关键作用，这些差异miRNAs和wnt信号通路相关蛋白均可能是特发性纤维化临床诊断和新药研发的标志物，其为肺纤维化治疗策略提供了理论支持，也为治疗肺纤维化相关的职业病提供指导性意见。在治疗肺纤维化等职业病的新药研发中，高度特异miRNAs也可能成为新的药物靶点，也为我们后续深入研究职业暴露诱发干燥综合征合并肺纤维化确定了研究方向。