畜禽粪便中抗生素残留检测样品的前处理技术及其分析方法研究进展

张 薇， 宋艳红， 赵平伟， 武晋孝， 郭 禹，米彦飞， 刘春龙， 李燕秀， 冯俊吾*

（1.山西省检验检测中心，山西省标准计量技术研究院，山西太原 030027；2.山西农业大学，山西晋中 030801）

抗生素又称抗菌素，其是放线菌、细菌、真菌等微生物的次级代谢物质，也可以通过化学合成、半合成法制得。在一定浓度范围内抗生素具有杀死或抑制病原菌的作用，所以在预防以及诊断细菌疾病方面起了很大的作用。近几年，可以作为兽用抗菌药的抗生素广泛应用于畜禽养殖业。美国每年农业生产中使用的抗生素高达9000～13000 t（王冰等，2007），我国每年大约9.7万t抗生素被用于畜牧养殖业（周启星等，2007）。畜禽本身只能吸收少量的抗生素，约60%～90%的抗生素随畜禽粪便排出体外（Halling-sorensen等，1998）。高浓度残留的抗生素通过废水及粪肥的施用进入土壤和水环境中，造成水和土壤抗生素污染，还会影响土壤微生物群落结构及其活性，导致细菌出现耐药性，从而影响抗生素在人类和动物的治疗效果（Martinez，2008）。因此，许多国家已经陆续成立耐药监测系统，比如美国的NARMS、欧盟EARS-Net、加拿大的CIPARS，丹麦的DANMAP以及我国的CARSS系统（罗讯等，2019），并且我国农业农村部第194号公告规定，2020年7月1日起，禁止在饲料中添加有促生长用途的兽用抗菌药（中药类药物除外）。

随着人们对畜禽粪便中抗生素残留的危害性越来越关注，建立和完善畜禽粪便中残留抗生素的分析测定方法是研究抗生素各种环境行为的基础。现就畜禽粪便中几种常见抗生素的种类、作用机理、样品前处理方法及相关检测技术予以介绍，为畜禽粪便中抗生素残留的控制提供参考。

1 畜禽粪便中常见抗生素的种类

在畜禽养殖过程中被广泛使用的抗生素，包括大环内酯类、多肽类、氨基糖苷类（Huang等，2011）、四环素类、磺胺类、喹诺酮类六大类（Ostermann等，2013）。

1.1 四环素类抗生素 四环素类抗生素发现于20世纪40年代，是由放线菌产生的一类广谱抗生素，主要包括金霉素、土霉素、四环素、多西环素等。四环素类抗生素每个分子中都包含一个线性熔合的四环素核。该类化合物为酸碱两性化合物，在水中溶解度低，易溶于乙醇，在乙酸乙酯、乙腈等有机溶剂中的溶解度较小。四环素类抗生素通过阻止细菌的氨酰转运核糖核酸与核糖体结合位点的结合来阻止菌体蛋白合成从而产生抗菌作用。四环素类抗生素具有广泛的抗菌活性，对多数革兰氏阴性菌、阳性菌、衣原体及某些原虫等有抗菌作用。因其杀菌作用有效和副作用较小被广泛用于治疗人和动物的细菌性感染。

1.2 磺胺类抗生素 磺胺类抗生素是人工合成的抗生素，主要包括磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶等，具有抗菌谱广、性质稳定等优点。该类化合物为极性物质，在极性有机溶剂中溶解度较大。磺胺类抗生素的化学结构中有一个苯环，一个磺酰胺基以及一个对位氨基，对位上的游离氨基是抗菌活性部分。对氨基苯甲酸是叶酸的组成部分，而叶酸又是微生物生长所必需的物质。磺胺类抗生素能与细菌生长繁殖所必需的对氨基苯甲酸产生竞争性拮抗作用，从而干扰细菌的酶系统对对氨基苯甲酸的利用产生抑菌作用。磺胺类抗生素是兽用抗生素中使用量最大的抗生素之一。

1.3 氟喹诺酮类抗生素 氟喹诺酮类抗生素是人工合成的一系列含氟的抗生素，具有抗菌活性强、抗菌谱广、与其他抗生素无交叉耐药性以及毒副作用小等优点。主要包括环丙沙星、氟罗沙星、恩诺沙星、依诺沙星等，其中诺氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星和培氟沙星不允许在食品动物中使用。细菌DNA旋转酶能参与细菌DNA的复制、转录等；拓扑异构酶Ⅳ在细菌细胞壁的分裂中对细菌染色体起关键作用。氟喹诺酮类抗生素能抑制以上两种酶，协同防止细菌的复制而表现出抗菌作用。氟喹诺酮类抗生素作为饲料添加剂被广泛用于畜禽养殖业的疾病防治。

1.4 大环内酯类抗生素 大环内酯类抗生素是由链霉菌产生的广谱抗生素，具有基本的内酯环结构，可有效抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。主要包括罗红霉素、泰乐菌素、泰妙菌素、泰拉菌素、替米考星等。细菌细胞在蛋白质合成的过程中分裂的核糖核蛋白体有两种亚单位，大环内酯类抗生素能与其中一种亚单位结合，抑制肽酰基转移酶，影响核糖核蛋白的移位过程，阻碍肽链的增长，抑制细菌蛋白质的合成从而产生抗菌作用。

1.5 多肽类抗生素 多肽类抗生素是具有多肽结构特征的一类抗生素，主要包括糖肽类抗生素（万古霉素、去甲万古霉素和替考拉宁）、多黏菌素类（多黏菌素B、多黏菌素E）和杆菌肽类（杆菌肽、短杆菌肽）。万古霉素可以与细菌细胞壁黏肽的侧链终端作用形成复合物，从而阻断细胞壁蛋白质的合成。多黏菌素类抗生素环形多肽部分的氨基与细菌外膜脂多糖产生静电作用，破坏外膜的完整性，使药物的脂肪酸得以穿透进去，进而增加胞浆膜的渗透性，促使胞浆内的磷酸、核苷等小分子外逸，造成细菌功能障碍直至死亡。杆菌肽是抑制细菌细胞壁的合成；短杆菌肽是改变细菌胞浆膜的渗透性。多肽类抗生素的抗菌谱窄，虽然抗菌作用强，但具有不同程度的肾毒性，主要用于治疗对其敏感的多重耐药菌造成的重症感染。

1.6 氨基糖苷类 氨基糖苷类抗生素是由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接成的苷类抗生素，主要包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星等。氨基糖苷类抗生素可影响细菌蛋白质合成的全过程，包括妨碍细菌合成初始复合物，诱导其合成错误的蛋白以及阻抑其释放合成蛋白，从而产生抗菌性。因为氨基糖苷类抗生素仅对需氧菌有效，对厌氧菌无效，所以其主要用于敏感需氧革兰氏阴性杆菌所致的全身感染的治疗。

2 畜禽粪便样品的提取和净化

2.1 畜禽粪便中残留抗生素的提取 目前常用于提取样品中抗生素的溶剂有甲醇、乙腈等。EDTA-Mcllvaine缓冲液能有效降低抗生素与金属离子的鏊合，酸化的乙腈有利于提取猪粪便中的抗生素。常用的提取方法有：（1）超声提取法：借助超声波的空化效应，简单高效，成本低，在多种物质的样品提取中都有运用；（2）振荡提取法：设备简单、便于操作；（3）分散液液微萃取：适用于小体积样品富集分析，简便有效；（4）加速溶剂萃取：在高温高压条件下，利用有机溶剂提取样品中待测成分的方法；（5）微波辅助萃取法：利用微波辐射提取固体样品中的目标物，该方法应用广泛，但是不适用于热不稳定性化合物的前处理过程。目前畜禽粪便中残留抗生素的提取方法主要是超声提取法和振荡提取法。

2.2 畜禽粪便中残留抗生素提取液的净化 目前，研究者们在对样品提取液中的目标药物富集净化做了大量的研究。周婧 （2019）分析比较了Waters Oasis HLB（6 mL，500 mg） 小 柱 、Agela Technologies Cleanert PEP（6 mL，500 mg）和Waters PRiME HLB（6 mL，200 mg）三种小柱的净化效果，结果显示HLB柱回收率为50.40%～119.55%；Cleanert PEP对磺胺类药物的效果比较好，磺胺类回收率为61.22%～109.42%，但对其他抗生素回收率不高；PRiME HLB回收率为0%～175.20%。综合考虑，HLB柱能够满足分析要求且稳定性较好，原因可能是HLB小柱的填料既有亲脂性的二乙烯基苯又有亲水性的N-乙烯吡咯烷酮，从而对不同极性以及酸碱性的目标药物有较好的净化及浓缩效果。因此，如果所检测的目标药物的类别较多、性质差异较大，保留容量较大的Waters Oasis HLB柱的效果会更好。洗脱液要有一定的极性，但是不能太强，避免洗脱下不必要的物质，影响提取效果。储意轩（2018）分别用甲醇和乙腈作为洗脱液进行洗脱效果比较，结果显示用甲醇洗脱所得的磺胺类和四环素类七种抗生素回收率均比乙腈高。

QuEChERS （Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）是比较常用的样品提取和净化的前处理技术。粪便样品经过乙腈提取后，盐析，分散固相萃取成分。该方法准确，重复性好，灵敏度高，操作简单。郑颜（2021）制备了Fe3O4-MWCNTs复合材料，为分散固相萃取引入了一种可重复利用的新型萃取剂。Fe3O4-MWCNTs复合材料在使用前后没有明显的差异，回收率为80%～120%，具有良好的稳定性和可重复利用性，为环境样品中其他痕量污染物的检测提供参考。这个方法改进了QuEChERS传统的前处理方法，更加简便高效。

畜禽粪便基质成分复杂，其中水分约占3/4，固体成分中30%是死细菌，10%～20%是无机盐，10%～20%是脂肪，2%～3%是蛋白质，30%是未消化的食物和消化液中的固体成分。研究表明，土壤中有机质含量到4.9%时就可能吸附兽药（Amador等，2019），而畜禽粪便中的有机质含量远高于4.9%，可能对兽药有着更强的吸附力。不同动物的粪便具体成分也不一样。鸡粪便通常比猪粪便含有更多的金属离子，四环素类抗生素易与金属离子鳌合，导致其不能被完全提取。猪粪便比鸡粪便含有更多的纤维素和生物絮凝体，其中可能包埋或者吸附残留的抗生素（费辉盈等，2006）。这些因素都可能影响抗生素的提取效率。另一方面，提取液中的杂质过多不仅会影响抗生素的检测结果，而且会缩短仪器的使用寿命。因此，样品前处理技术成为畜禽粪便中抗生素残留检测技术发展的关键。目前常用前处理方法见表1。

表1 畜禽粪便前处理方法

3 抗生素检测方法

最早应用于抗生素检测的方法是生物学方法，但是生物学的方法耗时较长，并且灵敏度很低。目前，用于抗生素残留检测的方法主要有高效液相色谱及液相色谱串联质谱 （Amador等，2019）。

3.1 高效液相色谱法 高效液相色谱以液体作为流动相，极性不同的单一溶剂或者比例不同的混合溶剂、缓冲液等通过高压泵输入作为固定相的色谱柱中。各成分在柱内被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。对于复杂基质高效液相色谱也具有较好的分离效果，并能准确的定性定量分析，因此在抗生素残留检测中应用广泛。表2为高效液相色谱法检测畜禽粪便中抗生素残留的方法汇总。

表2 高效液相色谱法检测畜禽粪便中抗生素残留的方法汇总

3.2 液相色谱串联质谱 高效液相色谱与高选择性、高灵敏度的串联质谱结合可以克服背景干扰，对复杂样品仍可达到很高的灵敏度，是畜禽粪便抗生素残留检测方法研究的重要方向。液相色谱串联质谱既结合了液相色谱对复杂基质的高分离能力又有质谱独特的灵敏度、选择性、相对分子质量以及结构性，对复杂基质可以进行更准确的定性、定量分析，适合残留抗生素的痕量检测。表3为液相色谱串联质谱检测畜禽粪便中抗生素残留的方法汇总。

表3 液相色谱串联质谱检测畜禽粪便中抗生素残留的方法汇总

4 结论与展望

目前常用的的畜禽粪便中抗生素残留的检测方法存在前处理过程繁琐、实验成本高、便捷性较差等问题。因此要想满足畜禽粪便中抗生素残留检测的实际需要，一方面要研究新的抗生素检测方法，以期找到更为简便、精确的检测方法；另一方面需要对现有方法进行优化，提高实用性和可操作性，还要进行快速筛选方法以及高通量确证方法的研究。高效毛细管电泳法是以毛细管作为分离通道，高压电场作为驱动力，根据供试品中各个组分之间的淌度和分配行为上的差异而实现分离。毛细管电泳技术不仅有高压电泳及高效液相色谱的优点，而且仪器简单，易自动化，分析速度快，效率高，操作模式多，开发方法容易，消耗少，在畜禽粪便中残留抗生素的快速检测中具有很大应用潜力。